PD-1- CD45RA+效應(yīng)記憶CD8 T細(xì)胞和CXCL10+巨噬細(xì)胞 與晚期肝細(xì)胞癌中阿特朱單抗加貝伐單抗的反應(yīng)相關(guān)

        阿特朱單抗加貝伐單抗 (atezo/bev) 的組合極大地改變了晚期 HCC (aHCC) 的治療格局，在一些患者中實(shí)現(xiàn)了持久的緩解。使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，我們描述了接受 atezo/bev 治療的 aHCC 患者的腫瘤內(nèi)和外周免疫環(huán)境。來(lái)自具有持久反應(yīng)的患者的腫瘤富含 PDL1+ CXCL10+ 巨噬細(xì)胞，并且根據(jù)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分析，表達(dá)高水平的 CXCL9/10/11，并預(yù)計(jì)會(huì)吸引外周 CXCR3+ CD8+ 效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞 (CD8 TEM) 進(jìn)入腫瘤。基于 T 細(xì)胞受體共享和偽時(shí)間軌跡分析，我們提出 CD8 TEM 優(yōu)先分化為克隆擴(kuò)增的 PD1- CD45RA+ 效應(yīng)記憶 CD8+ T 細(xì)胞（CD8 TEMRA），具有明顯的細(xì)胞毒性。相比之下，在無(wú)反應(yīng)者中，CD8 TEM 仍凍結(jié)在其效應(yīng)記憶狀態(tài)。最后，在應(yīng)答者中，CD8 TEMRA 顯示出與血液高度共享的 T 細(xì)胞受體，這與他們的巡邏活動(dòng)一致。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于了解 aHCC 中對(duì) atezo/bev 反應(yīng)的可能機(jī)制。

        該研究于2023年11月發(fā)表在《Nature communications》，IF：16.6。

技術(shù)路線：

結(jié)果:

1、晚期HCC的腫瘤微環(huán)境和外周免疫系統(tǒng)

        對(duì) 38 名aHCC 患者進(jìn)行了治療前組織活檢，進(jìn)行了scRNA-seq（圖 1a），從 97,947 個(gè)單細(xì)胞中獲得了高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖 1b）。隨后的降維和聚類分析確定了幾個(gè)簇，根據(jù)標(biāo)記基因表達(dá)分配給 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞 (30%)、B 細(xì)胞 (5%)、髓系細(xì)胞 (12%) 和基質(zhì)細(xì)胞類型 (12%)。我們還鑒定了一個(gè)增殖簇，主要由增殖的 T 細(xì)胞和一大群 HCC 癌細(xì)胞（40%）組成，表達(dá)與正常肝功能相關(guān)的基因（ALB、HP、FGA、FGB）和肝癌（AFP、SPINK1、GPC3、AKR1C1）。同樣，對(duì)連續(xù)治療（第 0-3-6 周）PBMC 樣本（n = 72，來(lái)自 25 名 aHCC 患者）進(jìn)行單細(xì)胞分析，產(chǎn)生了 268,807 個(gè) PBMC 的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并注釋為各自的使用標(biāo)記基因識(shí)別細(xì)胞類型（圖1c）。這些數(shù)據(jù)共同提供了接受全身療法治療的 aHCC 患者的 TME 和外周免疫系統(tǒng)的獨(dú)特細(xì)胞圖譜，并為未來(lái)的研究工作提供了寶貴的資源。

2、腫瘤內(nèi) T/NK 細(xì)胞組成不同于外周 T/NK 細(xì)胞組成

        首先，我們更詳細(xì)地探索了 TME 和外周血的 T/NK 細(xì)胞劃分。分別對(duì)總共 26,380 個(gè)腫瘤內(nèi) T-/NK 細(xì)胞和 170,919 個(gè)外周 T-/NK 細(xì)胞（PBMC 的 64%）進(jìn)行亞聚類，我們鑒定了 CD4 T 細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的幾種表型細(xì)胞（NK細(xì)胞）（圖2a，b）。值得注意的是，CD4（CD4 CXCL13）和CD8（CD8 TEX）“耗盡”T細(xì)胞是TME所獨(dú)有的，其特征是PDCD1（PD1）和其他已知耗盡標(biāo)記物的最高表達(dá)。根據(jù)典型標(biāo)記基因（CX3CR1、SPON2、FGFBP2）的表達(dá)，我們?cè)?span>TME和外周血中鑒定出了CD45RA效應(yīng)記憶CD8 T細(xì)胞（CD8 TEMRA）。我們使用 TotalSeq-C 數(shù)據(jù)證實(shí)了它們?cè)诘鞍踪|(zhì)水平上的 CD45RA 表達(dá)。重要的是，CD8 TEMRA 在表型上相似，并且聚集在細(xì)胞毒性 NK 細(xì)胞附近，但根據(jù)其 CD8（CD8A、CD8B）的表達(dá)和有效 TCR 序列的檢測(cè)進(jìn)行區(qū)分。

        結(jié)合scRNA-seq和scTCR-seq，我們?cè)?span>TME中鑒定出17,842個(gè)T細(xì)胞攜帶12,690個(gè)獨(dú)特的TCR，而115,711個(gè)外周T細(xì)胞攜帶90,188個(gè)獨(dú)特的TCR序列。我們根據(jù)相同的 TCR 序列鑒定了 TCR 克隆型，并將顯性克隆型定義為由 >5 個(gè) T 細(xì)胞共享的 TCR。在腫瘤內(nèi) T 細(xì)胞中，優(yōu)勢(shì)克隆型集中在效應(yīng)細(xì)胞（CD8 TEM、CD8 TEMRA）和“經(jīng)歷過(guò)抗原”的 T 細(xì)胞簇（CD8 TEX、CD4 CXCL13；圖 2c）內(nèi)，而非優(yōu)勢(shì)克隆型主要發(fā)現(xiàn)于初始、記憶或調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞亞型。同樣，主要的外周 T 細(xì)胞克隆型與腫瘤中的表型對(duì)應(yīng)物一致，集中在外周效應(yīng) T 細(xì)胞內(nèi)（CD8 TEM、CD8 TEMRA、CD4 TCYTO；圖 2d）。

        簡(jiǎn)而言之，雖然表型不同，但 CD8 效應(yīng) T 細(xì)胞（CD8 TEM、CD8 TEMRA）和 CD8 耗竭 T 細(xì)胞（CD8 TEX）在腫瘤和外周血中均具有顯性 T 細(xì)胞克隆型特征。

3、克隆擴(kuò)增的 CD8 TEMRA 與阿特朱單抗/貝伐單抗的反應(yīng)相關(guān)

        為了確定與 atezo/bev 反應(yīng)相關(guān)的 CD8 T 細(xì)胞表型，我們比較了有反應(yīng)者和無(wú)反應(yīng)者之間腫瘤和外周免疫系統(tǒng)的幾個(gè)特征，包括 i) 腫瘤內(nèi) CD8 T 細(xì)胞的豐度，ii)腫瘤和外周 TCR 庫(kù)以及 iii) 腫瘤和血液之間 TCR 共享的程度。

        首先，比較有反應(yīng)者和無(wú)反應(yīng)者之間 TME 中各種 T 細(xì)胞表型的相對(duì)豐度，我們發(fā)現(xiàn) CD8 TEMRA 在有反應(yīng)的腫瘤中更豐富（p = 0.04），而 CD8 TEM 在無(wú)反應(yīng)者中增加（p = 0.005；圖2e)。值得注意的是，盡管CD8 TEX表達(dá)了最高水平的治療靶點(diǎn)PDCD1（PD1），但它們?cè)?span>TME中的存在并沒(méi)有根據(jù)反應(yīng)而不同（圖2e）。 TME 中 CD8 T 細(xì)胞的差異基因表達(dá)揭示了細(xì)胞毒性基因（GZMB、GNLY、PRF1、GZMH）和典型 CD8 TEMRA 標(biāo)記（FGFBP2、FCGR3A）的上調(diào)，表明 CD8 TEMRA 可能在實(shí)現(xiàn)對(duì) atezo/bev 的持久反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（圖2f）。相比之下，無(wú)反應(yīng)的腫瘤更具記憶性（FOS），并且 GZMK（一種典型的 CD8 TEM 標(biāo)記物）上調(diào)（圖 2f）。其次，有反應(yīng)的腫瘤的特點(diǎn)是具有更多克隆性的治療前 TCR 庫(kù)，而無(wú)反應(yīng)者則表現(xiàn)出更豐富、更多樣化的非克隆基線 TCR 庫(kù)（圖 2g）。計(jì)算基尼指數(shù)時(shí)，考慮到 TCR 均勻度（1-克隆性）和 TCR 豐富度，對(duì)于每個(gè) CD8 T 細(xì)胞表型，腫瘤內(nèi) CD8 TEM、CD8 TEMRA 和 CD8 TEX 的克隆擴(kuò)增程度最高（圖 2h 左）。重要的是，當(dāng)對(duì)atezo/bev的反應(yīng)進(jìn)行分層時(shí)，與無(wú)反應(yīng)者相比，有反應(yīng)的腫瘤中的CD8 TEMRA具有顯著更高的基尼指數(shù)（p = 0.045；圖2h右）。相反，在比較應(yīng)答者與非應(yīng)答者時(shí)，我們沒(méi)有檢測(cè)到 CD8 TEM 和 CD8 TEX 克隆擴(kuò)增的顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)表明，治療前存在于 TME 內(nèi)的克隆擴(kuò)增的 CD8 TEMRA 可能有助于 aHCC 中對(duì) atezo/bev 的反應(yīng)。

4、TCR 共享證實(shí) CD8 TEMRA 是 aHCC TME 中的關(guān)鍵效應(yīng) T 細(xì)胞

        由于與外周血T細(xì)胞共享相同TCR序列的腫瘤內(nèi)T細(xì)胞更有可能具有腫瘤反應(yīng)性，因此我們?cè)?span>17例接受atezo/bev治療的患者中探索了腫瘤和PBMCs之間共享的TCR，其中10例對(duì)atezo/bev有反應(yīng)。我們特別關(guān)注治療開(kāi)始前(PBMC第0周)腫瘤和外周血中存在的TCR序列，假設(shè)這些共享的TCR代表了針對(duì)腫瘤和由腫瘤驅(qū)動(dòng)的基線免疫反應(yīng)。共檢測(cè)到403個(gè)獨(dú)特的共享的，可能是“腫瘤特異性”的TCRs，約占腫瘤中檢測(cè)到的所有TCRs的7.1%，而在外周血中檢測(cè)到的所有TCRs的0.6%。為了校正每個(gè)樣本中檢測(cè)到的T細(xì)胞數(shù)量，我們計(jì)算了共享TCR相對(duì)于PBMCs中檢測(cè)到的TCR總數(shù)的比例，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答者顯示出更高程度的TCR共享(平均2%;P = 0.03;圖3 a)。在共享外周T細(xì)胞的比例中檢測(cè)到類似的趨勢(shì)。重要的是，TCR共享的增加與顯著較長(zhǎng)的PFS相關(guān)(中位PFS為12個(gè)月vs 2個(gè)月;P = 0.012;圖3b)，支持我們的假設(shè)，即TCR共享可能確實(shí)鑒定了腫瘤內(nèi)真正靶向腫瘤的部分T細(xì)胞。

        將這些共享TCRs與TME中的T細(xì)胞表型聯(lián)系起來(lái)(圖3c左)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)代表CD8 T細(xì)胞，集中于CD8效應(yīng)亞型(CD8 TEM和CD8 TEMRA)。事實(shí)上，63%的CD8 TEMRA和22%的CD8 TEM在治療前的外周血中也檢測(cè)到TCR，而CD8 TEX在治療前的外周血中也檢測(cè)到TCR (13%)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，差別基因表達(dá)表明，在共享TCRs的腫瘤內(nèi)T細(xì)胞(n = 970個(gè)共享T細(xì)胞)中，CD8 (CD8A和CD8B)和細(xì)胞毒性標(biāo)記(GZMA、GZMB、GZMH、GNLY、PRF1)以及典型的CD8 TEMRA標(biāo)記(CX3CR1、SPON2、FGFBP2)過(guò)表達(dá)。相反，只在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的攜帶TCR的T細(xì)胞富集了耗竭標(biāo)志物(CTLA4)和調(diào)節(jié)基因(FOXP3、TNFRSF4;圖3 d)。重要的是，雖然共有的CD8 TEM存在于治療有效組和治療無(wú)效組的TME中(分別占所有瘤內(nèi)CD8 TEM的18%和8%)，共有的CD8 TEMRA幾乎只出現(xiàn)在治療有效組的腫瘤中(在所有瘤內(nèi)CD8 TEMRA中，治療有效組為57%，而治療無(wú)效組為6.1%;圖3c右)。

        CD8 TEMRA被描述為“近期激活的”CD8效應(yīng)記憶T細(xì)胞。不表達(dá)PDCD1或其他傳統(tǒng)上與抗原經(jīng)歷相關(guān)的標(biāo)記物。相反，它們?cè)诳乖碳ず笾匦卤磉_(dá)CD45RA。它們被認(rèn)為是一種哨兵樣T細(xì)胞表型，在抗原頻繁接觸的炎癥部位巡邏?；谒鼈兏弑磉_(dá)的細(xì)胞毒性標(biāo)記(PRF1, NKG7, GZMA, GZMB, GZMH, GNLY;圖3e)，其依賴于T細(xì)胞及其靶細(xì)胞和指導(dǎo)其遷移到炎癥組織的組成性表達(dá)受體之間的直接相互作用(CX3CR1)。

5、與腫瘤抗原的相互作用驅(qū)動(dòng)腫瘤內(nèi)向 CD8 TEMRA 分化

        為了深入了解 TME 中 CD8 TEMRA 的起源，我們使用 Slingshot 計(jì)算了腫瘤內(nèi) CD8 T 細(xì)胞的偽時(shí)間軌跡。我們認(rèn)為 CD8 初始 T 細(xì)胞（CD8 TN）是軌跡的根源，因?yàn)樗鼈兙哂凶罡叩?span> TCR 豐度。與之前的報(bào)道一致，初始 T細(xì)胞連接到TEM細(xì)胞，然后分成三個(gè)不同的軌跡，將初始 T細(xì)胞和TEM T細(xì)胞連接到TRM、TEMRA和TEX（圖4a左）。 TCR 豐富度沿著每條軌跡下降。 CD8 TEM顯示大多數(shù)TCR克隆型與TEX重疊，但也與TEMRA和TRM重疊（圖4b），而屬于不同譜系的T細(xì)胞之間幾乎沒(méi)有TCR重疊，這支持了三種軌跡的有效性。沿每個(gè)軌跡分析標(biāo)記基因證實(shí)了它們的功能注釋。

        當(dāng)繪制沿每個(gè)軌跡的 T 細(xì)胞密度時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)響應(yīng)者和非響應(yīng)者之間存在顯著差異。應(yīng)答者中的腫瘤內(nèi) CD8 T 細(xì)胞能夠進(jìn)化為更加分化的表型，這種效應(yīng)在 TEMRA 軌跡中最為明顯，而無(wú)應(yīng)答者似乎凍結(jié)在假時(shí)間的早期階段（p < 0.001；圖 4c） 。沿著有反應(yīng)的腫瘤的 TEMRA 和 TEX 軌跡，基尼指數(shù)穩(wěn)步增加。重要的是，當(dāng)評(píng)估沿著 CD8 軌跡的共享 T 細(xì)胞的密度時(shí)（圖 4a 右），我們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在應(yīng)答者的 TEMRA 軌跡末端明顯富集（圖 4d）。相比之下，沿著 TEX 軌跡，在 TEM 階段，應(yīng)答者和非應(yīng)答者的 T 細(xì)胞密度都達(dá)到最大。

        然后，我們使用 TradeSeq 來(lái)識(shí)別沿 TEMRA 與 TEX 軌跡差異表達(dá)的基因組（使用 diffEnd 測(cè)試）。來(lái)自 REACTOME 或“GO：生物過(guò)程”基因集的總共 13 條途徑和 46 條途徑分別在 CD8 TEMRA 和 TEX 軌跡中顯著富集。重要的是，TEMRA軌跡以與先天樣免疫相關(guān)的途徑為主（圖4e），反映了它們作為通過(guò)直接細(xì)胞毒性消除癌細(xì)胞的有效效應(yīng)T細(xì)胞的作用。相比之下，TEX 軌跡富含涉及 IFNG 信號(hào)傳導(dǎo)以及免疫細(xì)胞激活和分化的途徑。為了了解哪些因素驅(qū)動(dòng)這種雙重分化，我們?cè)俅问褂?span> TradeSeq 評(píng)估軌跡分歧點(diǎn)之前和之后表達(dá)模式的差異（使用 EarlyDEG 測(cè)試），并發(fā)現(xiàn)總共 333 條途徑被富集。重要的是，涉及抗原結(jié)合的途徑排名最高，表明進(jìn)一步分化需要與抗原直接相互作用（圖4f）。

        最后，為了研究治療中的免疫反應(yīng)，我們使用了治療前 PBMC 和 TME 中存在的共享 TCR 克隆型，將它們與外周血中的表型聯(lián)系起來(lái)，并在治療期間（第 0-3-6 周）采樣的 PBMC 中跟蹤它們?cè)谥委熯^(guò)程中的演變。首先，在 TME 中表征 CD8 TEMRA 的 422 個(gè)獨(dú)特 TCR 主要在外周 CD8 TEMRA 中發(fā)現(xiàn)。治療前，它們占應(yīng)答者所有 CD8 外周 T 細(xì)胞的 18%（6575 個(gè)外周 CD8 T 細(xì)胞中的 1183 個(gè)），而在無(wú)應(yīng)答者中僅占 2%（圖 4g 左）。追蹤治療期間的演變，有反應(yīng)者的 TCR 共享程度仍然很高（6 周后為 18.6%），而我們沒(méi)有觀察到無(wú)反應(yīng)者有任何顯著變化（第 6 周為 1.6%；圖 4g 左）。這與 TME 中 CD8 TEX 中發(fā)現(xiàn)的 1065 個(gè)獨(dú)特 TCR 形成鮮明對(duì)比，在應(yīng)答者和非應(yīng)答者中，在不到 1% 的 CD8 外周 T 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了這些 TCR（圖 4g 右）。此外，在治療期間，在腫瘤內(nèi) CD8 TEX 中發(fā)現(xiàn)的這些 TCR 并未出現(xiàn)在外周血中。

        總而言之，這些數(shù)據(jù)表明，雖然 CD8 TEM 存在于應(yīng)答者和非應(yīng)答者的 TME 中，但在受到腫瘤抗原刺激后，CD8 TEM 更有可能在應(yīng)答者中分化為 CD8 TEMRA，從而可能導(dǎo)致直接抗-腫瘤細(xì)胞毒性。此外，CD8 TEMRA 在應(yīng)答者中顯示出與 PBMC 顯著的 TCR 共享，并且在使用 atezo/bev 治療后繼續(xù)這樣做，這與它們的巡邏表型一致。相比之下，從 CD8 TEM 到 CD8 TEX 的腫瘤內(nèi)分化在atezo/bev 的應(yīng)答者和無(wú)應(yīng)答者中同樣發(fā)生，并且 CD8 TEX 在治療前不與血液共享 TCR，在atezo/bev 治療期間也不會(huì)出現(xiàn)。

6、表達(dá)促炎性 PDL1 的 CXCL10+ 巨噬細(xì)胞與反應(yīng)相關(guān)

        雖然腫瘤內(nèi) CD8 TEMRA 與隨后對(duì) atezo/bev 的反應(yīng)相關(guān)，但它們不表達(dá) PDCD1 (PD1)。因此，我們想知道 aHCC 中 atezo/bev 的真正靶點(diǎn)是否可能在表達(dá) PDL1 的細(xì)胞中找到。 TME 中 CD274 (PDL1) 的表達(dá)普遍較低，但在髓系細(xì)胞中可清晰檢測(cè)到。因此，我們將 11,678 個(gè)髓系細(xì)胞亞聚類為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞 (n = 10 609) 和樹(shù)突細(xì)胞 (DC；n = 764)。在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞區(qū)室中，我們鑒定了幾種與腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞（TAM）亞型（圖5a），其中大多數(shù)表達(dá)高水平的抗炎標(biāo)志物，表明aHCC中主要是免疫抑制性基線TME。然而，我們還發(fā)現(xiàn)了促炎性CXCL10+ TAM，其特征是參與T細(xì)胞募集（CXCL9、CXCL10）和干擾伽瑪信號(hào)傳導(dǎo)（STAT1、IDO1、GBP1）的基因高表達(dá)。

        比較有反應(yīng)和無(wú)反應(yīng)腫瘤之間各種 TAM 亞型的相對(duì)豐度，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)反應(yīng)者具有更高豐度的表達(dá) TREM2 的巨噬細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞之前被鑒定為 HCC 腫瘤中的免疫抑制性巨噬細(xì)胞，它們的存在與抗 PD1 療法的耐藥性有關(guān)。差異基因表達(dá)顯示，有反應(yīng)的腫瘤巨噬細(xì)胞區(qū)室中涉及 T 細(xì)胞募集（CXCL9、CXLC10）和干擾素-γ 活性（GBP1、STAT1）的基因富集，而無(wú)反應(yīng)者則富集免疫抑制標(biāo)記物（GPNMB、CCL18；圖5b）。有反應(yīng)的腫瘤還表現(xiàn)出較高水平的 CCL2，這是一種有效的單核細(xì)胞吸引趨化因子，但也參與將其他免疫細(xì)胞招募到 TME 中。最后，應(yīng)答者表現(xiàn)出較高的 SPP1 表達(dá)，此前該表達(dá)與肺癌 CPI 單一療法的應(yīng)答相關(guān)。其他通路分析證實(shí)，響應(yīng)腫瘤的巨噬細(xì)胞在促炎通路中富集。重要的是，平均而言，應(yīng)答者的髓系細(xì)胞表達(dá)顯著更高水平的 CD274（圖 5c 頂部）。更具體地說(shuō)，CD274 表達(dá)在 Macro CXCL10 中最高，而源自響應(yīng)腫瘤的 Macro CXCL10 顯示出更高的 CD274 表達(dá)（圖 5c 底部）。 Macro CXCL10 中 CD274 (PDL1) 的高表達(dá)也與較長(zhǎng)的 PFS 相關(guān)（中位 PFS 為 13 個(gè)月與 3 個(gè)月；p = 0.035；圖 5d）?？偠灾瑢?duì) atezo/bev 的反應(yīng)與治療前 TME 中激活的、促炎的、表達(dá) PDL1 的骨髓成分相關(guān)。

7、表達(dá) PDL1 的 CXCL10+ 巨噬細(xì)胞將效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞招募到 TME 中

        腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與外周 T 細(xì)胞招募至 TME 相關(guān)。因此，我們使用 CellChat 來(lái)預(yù)測(cè)髓系細(xì)胞和 T 細(xì)胞之間的受體-配體相互作用。首先，分別計(jì)算應(yīng)答者和非應(yīng)答者 TME 中免疫細(xì)胞類型之間的顯著相互作用，我們發(fā)現(xiàn)總體而言，應(yīng)答者表現(xiàn)出更多的相互作用可能性。重點(diǎn)關(guān)注 CXCL 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)所有患者的肝臟駐留巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞之間都存在預(yù)測(cè)的相互作用，無(wú)論反應(yīng)如何。相反，與無(wú)反應(yīng)者相比，有反應(yīng)的腫瘤顯示出更多可預(yù)測(cè)的CXCL10+巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞區(qū)室之間的相互作用（圖5e）。雖然CXCL12/CXCR4相互作用幾乎完全起源于Kupffer細(xì)胞，在應(yīng)答者和非應(yīng)答者中均發(fā)現(xiàn)，但與非應(yīng)答者相比，CXCL9/10/11和CXCR3配體-受體對(duì)在應(yīng)答者中顯著富集（圖5f） 。

        在TME中，CXCR3在幾種激活的T細(xì)胞亞型（即CD4 CXCL13和CD8 TEX，以及CD4 TEM和CD8 TEM，圖5g）中顯著表達(dá)，但不在CD8 TEMRA中表達(dá)，并且沿著TEMRA軌跡，CXCR3表達(dá)達(dá)到其峰值位于效應(yīng)器記憶狀態(tài)。在外周T細(xì)胞中，CXCR3主要在效應(yīng)記憶T細(xì)胞中表達(dá)（圖5h）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們假設(shè) CXCR3 與其配體 CXCL9/10/11 之間的相互作用在將外周 CD8 效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞 (CD8 TEM) 招募到 TME 中起著重要作用。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們?cè)俅问褂?span> CellChat 探索腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞和外周 CD8 T 細(xì)胞之間的受體-配體相互作用。事實(shí)上，考慮到所有細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn) CD8 外周 T 細(xì)胞是應(yīng)答者中最主要的信號(hào)“接收器”（圖 5i），與無(wú)應(yīng)答者中的表型對(duì)應(yīng)物相比，傳入信號(hào)的水平更高腫瘤。此外，在CXCL信號(hào)通路內(nèi)，與無(wú)反應(yīng)者相比，有反應(yīng)者的腫瘤內(nèi)CXCL10+巨噬細(xì)胞與外周CD8 TEM之間有更多預(yù)測(cè)的相互作用。

        總體而言，這支持了以下觀點(diǎn)：腫瘤內(nèi)髓樣區(qū)室（其特征是應(yīng)答者中 CXCL9/10/11 表達(dá)上調(diào)）可能參與 TME 中 CXCR3+ 效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞的招募和激活，可能發(fā)揮作用在確定對(duì) atezo/bev 的反應(yīng)中發(fā)揮作用。

8、CD8 TEMRA 和 CXCL10+ 巨噬細(xì)胞作為 aHCC 中阿替珠單抗/貝伐單抗反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物

        使用 scRNAseq，我們確定了克隆擴(kuò)增的細(xì)胞毒性 CD8 TEMRA 作為可能的效應(yīng)細(xì)胞，驅(qū)動(dòng)對(duì) atezo/bev 的反應(yīng)，而 CXCL10+ 巨噬細(xì)胞 (Macro CXCL10) 可能作為看門(mén)人，負(fù)責(zé)招募啟動(dòng)的效應(yīng)記憶外周 T 細(xì)胞（圖 6）。接下來(lái)，我們的目的是驗(yàn)證這些單細(xì)胞衍生的發(fā)現(xiàn)，并探索 CD8 TEMRA 和 Macro CXCL10 作為 aHCC 中 atezo/bev 反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的潛力。通過(guò)計(jì)算接受 atezo/bev (n = 253) 與索拉非尼 (n = 58) 治療的 aHCC 患者的 311 例治療前腫瘤活檢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中每個(gè)樣本的 CD8 TEMRA 和 Macro CXCL10 富集評(píng)分，我們發(fā)現(xiàn)高 CD8 TEMRA 和 Macro CXCL10 富集評(píng)分在atezo/bev治療的患者中，CXCL10富集評(píng)分與顯著較長(zhǎng)的PFS相關(guān)（圖7a頂部），但在索拉非尼治療的患者中則不然（圖7a底部）。此外，TME 中 CD8 TEMRA 和 Macro CXCL10 的存在密切相關(guān)（R = 0.84；p < 0.00001；圖 7b），支持它們一起填充 aHCC 的 TME 的觀點(diǎn)。事實(shí)上，將 CD8 TEMRA 和 Macro CXCL10 標(biāo)記基因組合到單個(gè)基因集中，我們發(fā)現(xiàn)“atezo/bev 反應(yīng)生物標(biāo)記物”富集得分較高的 atezo/bev 治療患者的 OS 和 PFS 顯著延長(zhǎng)（p = 0.049、 p < 0.0001），在索拉非尼治療的患者中未觀察到這種關(guān)聯(lián)（圖7c）。綜上所述，aHCC 患者治療前 TME 中 CD8 TEMRA 和 Macro CXCL10 的聯(lián)合存在與 atezo/bev 治療結(jié)果的改善相關(guān)，特別是驗(yàn)證了單細(xì)胞衍生的發(fā)現(xiàn)并強(qiáng)調(diào)了 'atezo 的潛在價(jià)值“/bev-反應(yīng)生物標(biāo)志物”作為 aHCC 中對(duì) atezo/bev 反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。

實(shí)驗(yàn)方法：

        scRNA-seq、T 細(xì)胞庫(kù)分析、細(xì)胞表面表位分析、TotalSeq-C、V(D)J 分析、TCR 共享、軌跡推斷分析、CellChat。

參考文獻(xiàn)：

        Cappuyns, S., Philips, G., Vandecaveye, V. et al. PD-1- CD45RA+ effector-memory CD8 T cells and CXCL10+ macrophages are associated with response to atezolizumab plus bevacizumab in advanced hepatocellular carcinoma. Nat Commun 14, 7825 (2023).