METTL1-WDR4 tRNA甲基化的結(jié)構(gòu)與機(jī)制

       特異性的、受調(diào)控的RNA修飾對(duì)于正確的基因表達(dá)是重要的。轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)富含各種化學(xué)修飾，影響其穩(wěn)定性和功。tRNA第46位的7-甲基鳥苷(m7G)是一種保守修飾，可調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)tRNA水平以影響細(xì)胞生長。METTL1-WDR4復(fù)合體在人類中負(fù)責(zé)m7G修飾，并且METTL1-WDR4的失調(diào)與腦畸形和多發(fā)性癌癥有關(guān)7-22。在這里，作者展示了METTL1和WDR4如何協(xié)同識(shí)別RNA底物并催化甲基化。METTL1-WDR4的晶體結(jié)構(gòu)和METTL1-WDR4-tRNA的低溫電鏡(Cro-em)結(jié)構(gòu)表明，復(fù)合蛋白表面通過形狀互補(bǔ)識(shí)別tRNA肘部。METTL1-WDR4-tRNA與S-腺苷蛋氨酸(SAM)或S-腺苷同型氨酸(SAH)的低溫電鏡結(jié)構(gòu)以及METTL1晶體結(jié)構(gòu)通過揭示多種狀態(tài)下的活性位點(diǎn)，為進(jìn)一步了解催化機(jī)制提供了新的見解。METTL1末端與tRNA、催化環(huán)和WDR4C端的構(gòu)象變化相結(jié)合，作為m7G甲基化的激活開關(guān)。因此，作者的結(jié)構(gòu)模型解釋了METTL1 N端翻譯后修飾如何調(diào)節(jié)甲基化。該研究闡明了METTL1修飾m7G的核心和調(diào)控機(jī)制，為理解其對(duì)生物學(xué)和疾病的貢獻(xiàn)提供了框架。該研究于2023年1月發(fā)表于《Nature》上，IF=64.8。題為“Structures and Mechanisms of tRNA Methylation by METTL1-WDR4”。

技術(shù)路線

研究內(nèi)容

1.      METTL1-WDR4復(fù)合體的架構(gòu)

       為了研究人METTL1甲基轉(zhuǎn)移酶的機(jī)制，作者首先用純化的重組蛋白重組了酶的活性。作者能夠分離METTL1和METTL1-WDR4復(fù)合物(圖1a)，但作者不能單獨(dú)純化WDR4，可能是因?yàn)?span>WDR4在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)需要METTL1才能正確折疊。對(duì)于RNA底物，作者選擇了tRNALys(tRNA-Lys-TTT-3)，因?yàn)槠渚哂谢虿痪哂行揎椈蚪Y(jié)合蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。此外，tRNALys在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中被m7G46一致修飾，甲基化依賴于METTL11，12，33的存在。在體外甲基化實(shí)驗(yàn)中，不含WDR4的純化METTL1不支持任何可檢測(cè)到的tRNA甲基化，但METTL1-WDR4復(fù)合物可以強(qiáng)有力地催化tRNALys的修飾。電泳遷移率轉(zhuǎn)移試驗(yàn)(emsa)表明，METTL1本身不能很好地結(jié)合tRNA，但在WDR4的存在下，三元配合物在低納摩爾范圍內(nèi)很容易觀察到親和力(圖1b，1c)。因此，作者成功地用tRNALys重建了METTL1-WDR4的甲基化活性。

       為了建立人類METTL1-WDR4復(fù)合體的三維模型，作者使用每個(gè)多肽(METTL120-265和WDR41-389)的截?cái)嘟Y(jié)構(gòu)獲得晶體，因?yàn)檩^長的結(jié)構(gòu)沒有結(jié)晶(圖1b)。蛋白質(zhì)復(fù)合體的整體結(jié)構(gòu)與酵母復(fù)合體(Trm8-Trm82)相似，但WDR4和Trm82之間觀察到更多的差異，可能是由于相對(duì)較低的序列一致性(~23%)(圖1d。WDR4的C端螺旋在作者的結(jié)構(gòu)中是新解析的;由于螺旋與對(duì)稱分子進(jìn)行晶體接觸，它相對(duì)于β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域的位置可能是靈活的。在形成絡(luò)合物后，METTL1和WDR4共埋藏了約1746 A2的表面積，其中包含許多疏水相互作用。極性殘基如WDR4的R170和E167以及METTL1的K143穩(wěn)定了域間接觸(圖1c，1d)。這些殘基的取代降低了酶的活性，表明觀察到的分子間相互作用對(duì)METTL1-WDR4的最佳活性很重要(圖1e)。在原始侏儒癥患者的R170位點(diǎn)觀察到WDR4的純合突變，這表明m7G46修飾活性的降低可能表現(xiàn)為一種主要的大腦異常。因此，METTL1和WDR4形成了一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物，具有復(fù)雜的分子間相互作用，這對(duì)優(yōu)化甲基轉(zhuǎn)移酶活性很重要。

       作者只能在沒有SAM或SAH的情況下結(jié)晶METTL1-WDR4復(fù)合體。為了更好地理解METTL1的催化功能，作者確定了甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域與SAM(2.25A)和SAH(1.93A)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(圖1e)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)彼此對(duì)齊良好(RMSD，0.15A)，并且與先前沉積在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的結(jié)構(gòu)和作者的METTL1-WDR4復(fù)合物結(jié)構(gòu)對(duì)齊良好(圖1f，1g)。SAM/SAH的腺嘌呤堿基與I108、M142和A141側(cè)鏈排列的疏水口袋吻合，并與N140和附近的肽主鏈形成氫鍵(圖1f)。更多的氫鍵穩(wěn)定了核糖羥基與E107之間的相互作用。SAM/SAH的氨基與G84和L160的主鏈羰基形成極性接觸，羧基與T238的羥基和E240的主鏈氨基形成氫鍵。為了從生物化學(xué)角度探討催化口袋，作者引入了關(guān)鍵相互作用殘基的單丙氨酸取代，并測(cè)定了體外甲基化活性。失去觀察到的側(cè)鏈相互作用對(duì)甲基化是有害的(圖1g)。因此，通過METTL1-SAM、METTL1-SAH和METTL1-WDR4復(fù)合體的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)和定點(diǎn)誘變研究，作者深入了解了人類m7G寫入復(fù)合體是如何形成并與甲基供體相互作用的。

圖1 METTL1-WDR4蛋白純化及tRNA復(fù)合體重組

2. METTL1-WDR4-tRNA的低溫電鏡結(jié)構(gòu)

       為了研究METTL1-WDR4復(fù)合物如何與底物tRNA結(jié)合，作者確定了METTL1-WDR4-tRNAlys復(fù)合物的低溫電鏡結(jié)構(gòu)，不含輔助因子(輔因子，3.72A)、含SAM(4.05A)和含SAH(3.53A)(圖2a-2c)。與結(jié)晶實(shí)驗(yàn)不同，作者可以使用全長構(gòu)建METTL1，但由于聚集，作者必須截?cái)?span>WDR4的C端23個(gè)殘基。為了穩(wěn)定SAM結(jié)合的復(fù)合物，作者使用METTL1 D163A代替野生型來防止催化(圖1g，2b)。最終的冷凍電鏡圖顯示了清晰定義的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域以及結(jié)合的tRNA的構(gòu)象，揭示了分子間相互作用是如何形成的，并隨著輔因子結(jié)合狀態(tài)而變化。METTL1-WDR4復(fù)合物的復(fù)合表面通過形狀和電荷互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)特異性RNA結(jié)合。穩(wěn)定的輔因子METTL1-WDR4-tRNA復(fù)合物與METT1-WDR4復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)保持相同的結(jié)構(gòu)域間取向(RMSD，0.83A)(圖5a)。在RNA存在的情況下，作者可以在SAM結(jié)合位點(diǎn)附近看到更多的長環(huán)(“催化環(huán)”)，但結(jié)構(gòu)變化是局部和有限的(圖5b)。與METTL1-WDR4結(jié)合的tRNALys的構(gòu)象也與未結(jié)合的tRNALys(相同序列但完全修飾)和tRNALys在不相關(guān)的蛋白RNA復(fù)合物中未修飾的另一種結(jié)構(gòu)相似。因此，為了形成載脂蛋白METTL1-WDR4-tRNA復(fù)合物，蛋白質(zhì)和RNA底物在結(jié)合時(shí)很少發(fā)生誘導(dǎo)折疊，這表明不需要明顯的構(gòu)象改變就可以形成穩(wěn)定的特異性蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。

       雖然整個(gè)域架構(gòu)看起來很相似，但是當(dāng)SAM或SAH結(jié)合METTL1-WDR4時(shí)，會(huì)發(fā)生局部構(gòu)象變化。一個(gè)明顯的變化是WDR4的C端螺旋在SAH綁定狀態(tài)下變得更加有序(圖2c)，螺旋趨于柔韌。在載脂蛋白和SAM結(jié)合狀態(tài)下僅觀察到弱螺旋密度。然而，在RNA和SAH的存在下，WDR4的C端螺旋明顯變得更加穩(wěn)定，從而與tRNA和METTL1接觸，進(jìn)一步加強(qiáng)了蛋白-RNA復(fù)合物。當(dāng)所有三種低溫電鏡結(jié)構(gòu)疊加時(shí)，在輔因子和SAH結(jié)合態(tài)之間觀察到最極端的構(gòu)象差異，而SAM結(jié)合結(jié)構(gòu)通常顯示中間狀態(tài)。METTL1錨定在WDR4上，向tRNA靠近，當(dāng)與輔因子結(jié)合時(shí)，tRNA發(fā)生輕微扭曲(圖2d)；相鄰的催化環(huán)擠壓到SAM/SAH結(jié)合結(jié)構(gòu)中的tRNA中(圖2e)。因此，盡管這三種狀態(tài)與tRNA在預(yù)先形成的METTL1-WDR4復(fù)合體上的對(duì)接在很大程度上相似，但輔因子結(jié)合誘導(dǎo)了局部構(gòu)象變化。

圖2 METTL1-WDR4-tRNALys結(jié)構(gòu)的低溫電鏡數(shù)據(jù)處理

3.      METTL1-WDR4的tRNA形狀識(shí)別

       在三種低溫電鏡結(jié)構(gòu)中，在SAH結(jié)合狀態(tài)下觀察到最廣泛的RNA-蛋白相互作用(圖3a)。大多數(shù)依賴于輔助因子的接觸是由METTL1進(jìn)行的，WDR4在所有三種結(jié)構(gòu)中都與tRNA保持類似的相互作用，即使是與剛性的C端螺旋。因此，與METTL1-RNA結(jié)合界面(apo:234A2，SAM:650A2，SAH:1422A2)相比，三種狀態(tài)下WDR4-RNA結(jié)合界面的面積更恒定。METTL1-WDR4上的RNA結(jié)合表面與基本斑塊重疊良好，這與強(qiáng)核酸結(jié)合蛋白的預(yù)期一致(圖3b)。這些RNA結(jié)合表面的殘基在不同物種之間也相對(duì)保。

       在所有三種結(jié)構(gòu)中，蛋白質(zhì)-RNA的接觸都涉及tRNA核心“肘”區(qū)——D環(huán)和T環(huán)相遇的地方(圖3c)。接吻環(huán)相互作用形成了tRNA的獨(dú)特三級(jí)結(jié)構(gòu)，RNA折疊由WDR4(界面I)和METTL1(界面II)形成的復(fù)合表面識(shí)別。tRNA彎頭由WDR4的M147、R165和T364以及METTL1的D32提供的疏水和pi堆疊相互作用杯化(圖3d)。WDR4的C端螺旋與d臂有額外的接觸，包括通過F365的環(huán)堆疊。此外，t臂磷酸主鏈與來自WDR4和METTL1的兩個(gè)基本側(cè)鏈簇進(jìn)行了幾個(gè)有利的接觸(圖3d，e)。在大多數(shù)情況下，用單丙氨酸取代破壞磷酸相互作用并不足以引起酶活性的顯著變化，但是肘部尖端附近的R165A和M147A突變會(huì)導(dǎo)致甲基化顯著降低，這表明檢測(cè)tRNA肘部的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征對(duì)于正確識(shí)別底物至關(guān)重要(圖3f)。截?cái)?span>WDR4C端螺旋或在其中間引入F365A突變可減少甲基化，這表明螺旋-RNA接觸也有助于有效結(jié)合。METTL1中的堿基殘基簇屬于催化環(huán)，它改變SAM/SAH結(jié)合狀態(tài)的構(gòu)象，以保持與tRNA的接觸，盡管RNA構(gòu)象發(fā)生了一些扭曲(圖2g，2h)。METTL1的K167似乎對(duì)生產(chǎn)催化至關(guān)重要-氨基夾在處于SAHbound狀態(tài)的C48和A50的兩個(gè)磷酸鹽之間(圖3e，3f)。幾乎所有RNA與蛋白質(zhì)的接觸都是靜電相互作用，這可能是因?yàn)榧谆D(zhuǎn)移酶必須通過它們的三級(jí)折疊來識(shí)別許多不同的tRNA序列。因此，METTL1-WDR4和tRNA可以通過形狀和電荷互補(bǔ)最低限度地形成穩(wěn)定的復(fù)合物，但伴隨輔因子結(jié)合的局部重排對(duì)于優(yōu)化酶活性至關(guān)重要。

圖3 METTL1-WDR4-tRNALys-SAM結(jié)構(gòu)的低溫電鏡數(shù)據(jù)處理

4.      深入了解METTL1的催化機(jī)制

       在METTL1-WDR4-tRNA的載脂蛋白結(jié)構(gòu)中，RNA結(jié)構(gòu)與分離的tRNA41的結(jié)構(gòu)非常相似。維持tRNA的自由構(gòu)象與一些甲基轉(zhuǎn)移酶不同，甲基轉(zhuǎn)移酶需要撬開D環(huán)和T環(huán)的相互作用，從而導(dǎo)致tRNA42的部分展開。事實(shí)上，可變環(huán)只與載脂蛋白狀態(tài)的蛋白質(zhì)部分相互作用，在界面處有明顯的間隙(圖4a)。為了支持G46甲基化，鳥嘌呤堿基仍然需要從埋在其他堿基之間的螺旋結(jié)構(gòu)中脫離出來，并通過有利的氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定下來。作者觀察到在輔因子狀態(tài)下tRNA的構(gòu)象異質(zhì)性最大，特別是在靠近可變環(huán)的反密碼子臂附近。為了分離出最穩(wěn)定的tRNA構(gòu)象，作者不得不在最初的3D分類和改進(jìn)后，在反密碼子臂附近使用掩膜來改進(jìn)圖譜。觀察到的異質(zhì)性表明，與METTL1-WDR4結(jié)合的tRNA會(huì)呼吸并形成替代構(gòu)象，其中大多數(shù)構(gòu)象并不普遍，無法重建。因此，盡管METTL1、WDR4和tRNA在這三種狀態(tài)下都能形成穩(wěn)定的復(fù)合物，但在載脂蛋白狀態(tài)下，tRNA的構(gòu)象更加靈活。

       在SAH結(jié)合結(jié)構(gòu)中，可變環(huán)展開，將G46堿基釋放到催化口袋中，導(dǎo)致更密切的蛋白質(zhì)-RNA接觸(圖4b)。隨著G46的翻轉(zhuǎn)，反密碼子臂也相對(duì)于tRNA的其余部分扭曲(圖4c)。為了使G46堿基的釋放在能量上有利，A21和A9環(huán)之間留下的空隙被METTL1的R24側(cè)鏈填充。扭曲的RNA構(gòu)象由附近額外的堿性殘基支持，如R22(帶環(huán)的pi-pi和pi-陽離子)和K243(帶磷酸主鏈)(圖4d，4e)。在SAH結(jié)合狀態(tài)下得到的RNA構(gòu)象似乎在整個(gè)顆粒中更均勻(與載脂蛋白狀態(tài)不同)，因?yàn)椴恍枰嬲謥慝@得具有獨(dú)特tRNA結(jié)構(gòu)的低溫電鏡圖。

       G46的N7位置距離SAM中會(huì)提供甲基的硫~5A，表明SAH結(jié)合結(jié)構(gòu)更接近活性構(gòu)象(圖4f)。鳥嘌呤環(huán)有三個(gè)酸性殘基(D163、D199和E240)，側(cè)鏈面向堿基的距離在4A以內(nèi)(圖4e)。D163最接近激活N7，但靠近較大環(huán)的D199和E240側(cè)鏈對(duì)于鳥嘌呤去質(zhì)子化以耗散甲基化獲得的正電荷也很重要。用丙氨酸取代三個(gè)酸性殘基中的任何一個(gè)都不利于甲基化活性(而附近的E239A突變的影響可以忽略不計(jì))，這表明它們都可能對(duì)催化作用有重要貢獻(xiàn)(圖4g)。此外，R24在RNA螺旋中替代G46對(duì)酶活性也至關(guān)重要。因此，作者揭示了關(guān)鍵的分子元素高產(chǎn)m7G甲基化，R24插入tRNA莖中以幫助G46堿基翻出，甲基受體最接近D163以激活，而更多的酸性殘基-d199和e240-圍繞鳥嘌呤支持催化。

       作者研究了可變環(huán)的序列如何有助于m7G修飾，因?yàn)樗诟淖儤?gòu)象時(shí)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生了很大的接觸。作者對(duì)tRNALys可變環(huán)中的嘌呤引入了過渡突變，發(fā)現(xiàn)G45或G46突變時(shí)甲基化受到抑制，盡管G44突變對(duì)甲基化沒有顯著影響(圖4h)。為了在不破壞tRNA折疊的情況下更廣泛地搜索突變，作者使用其他人類tRNA作為底物測(cè)量甲基化活性(圖4i，圖6c)。大多數(shù)甲基化tRNA在可變環(huán)33中包含RGGUY序列。然而，在tRNAgln中重構(gòu)RGGUY基序(通常折光到m7G修飾)只能部分恢復(fù)催化活性，這表明除了可變環(huán)序列外，還有其他特征涉及底物識(shí)別。在作者的低溫電鏡結(jié)構(gòu)中，只有少數(shù)核堿基直接接觸METTL1-WDR4，并且它們?cè)诓煌?span>tRNA之間的差異似乎與甲基化效率的變化無關(guān)。此外，甲基化效率與EMSA測(cè)量的RNA親和力無關(guān)，這表明復(fù)合物形成后的事件可能決定了甲基化水。從這些實(shí)驗(yàn)中，作者得出結(jié)論，可變環(huán)的序列和tRNA支架的其余部分對(duì)于確定m7G修飾的傾向都很重要。

圖4 METTL1-WDR4-tRNALys-SAH結(jié)構(gòu)的低溫電鏡數(shù)據(jù)處理

5. METTL1 N端發(fā)揮催化作用

       當(dāng)作者比較輔因子和SAH結(jié)合狀態(tài)下METTL1-WDR4-tRNA的結(jié)構(gòu)時(shí)，METTL1的N附近的冷凍電鏡圖譜隨著輔因子的增加變得更加突出，使作者能夠擴(kuò)展氨基酸P16-D32的模型(圖5a，5b)。這個(gè)區(qū)域在作者這里報(bào)道的其他結(jié)構(gòu)中是無序的。在METTL1-WDR4-tRNASAH復(fù)合體中，METTL1的n項(xiàng)通過SAH和d臂之間的狹窄通道，這可能解釋了為什么肽只有在RNA和輔因子存在時(shí)才變得有序(圖5c)。

       METTL1 N-端與tRNA、催化環(huán)和WDR4的C端螺旋進(jìn)行重要的特異性接觸，以協(xié)調(diào)催化袋附近的四元配合物組裝。METTL1 N項(xiàng)中的R22和R24已經(jīng)討論了它們從螺旋堆積中釋放G46的能力(圖4f-g和5c)。SAM/SAH結(jié)合袋進(jìn)一步穩(wěn)定了在疏水的腺苷環(huán)結(jié)合袋中的P29對(duì)M142的n項(xiàng)填料。METTL1 N項(xiàng)也支持?jǐn)D出的催化環(huán)構(gòu)象——p29和M30分別與W173和K172的脂肪族部分發(fā)生疏水相互作用(圖3e和5d)。此外，N-端的H26位于靠近催化袋的位置，與D163和甲基化鳥嘌呤的主鏈在氫鍵距離內(nèi)。為了獲得SAM結(jié)合結(jié)構(gòu)，作者使用了催化不活躍的METTL1D163A。突變D163可能也擾亂了其穩(wěn)定有序n項(xiàng)的能力，這可能是作者只能部分解決n項(xiàng)到H26的原因。由于催化環(huán)擠壓在SAM和SAH結(jié)合狀態(tài)下是相似的，因此輔因子的存在似乎足以觸發(fā)某些構(gòu)象變化。綜上所述，METTL1 N-端結(jié)合輔因子與更廣泛的RNA-蛋白接觸，其中G46在催化口袋中得到了適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。

       折疊的METTL1 N項(xiàng)也促進(jìn)了WDR4C端螺旋的排序。Y20和Y21的兩個(gè)酪氨酸環(huán)定位良好，可以與R378和Y371發(fā)生pi-pi相互作用，使得C端螺旋定位更加有利(圖5e)。由于WDR4的C端螺旋也與RNA結(jié)合(圖3d)，通過METTL1 N-端固化其構(gòu)象將導(dǎo)致更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。因此，當(dāng)METTL1 N端和WDR4 C端同時(shí)有序時(shí)，兩者共同提供了一個(gè)更擴(kuò)展的RNA結(jié)合位點(diǎn)。考慮到METTL1 N端在穩(wěn)定復(fù)雜結(jié)構(gòu)中發(fā)揮的多重作用，作者測(cè)試了接觸如何影響酶活性。作者發(fā)現(xiàn)，干擾與催化環(huán)或WDR4C端螺旋有利相互作用的突變都顯著降低了甲基化活性，突出了METTL1 N項(xiàng)在組織觀察到的構(gòu)象變化以獲得最佳甲基化效率方面的重要性(圖5f)。因此，作者的結(jié)構(gòu)和生化數(shù)據(jù)表明，METTL1 N項(xiàng)作為一個(gè)開關(guān)，協(xié)調(diào)對(duì)高產(chǎn)m7G寫入重要的多個(gè)分子事件。METTL1 N-端位于催化中心的中心，支持突出的催化環(huán)構(gòu)象，穩(wěn)定SAM結(jié)合袋，加強(qiáng)WDR4-RNA相互作用，激活G46堿基的釋放。

圖5 包含METTL1-WDR4- tRNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化

       先前的研究表明，METTL1 N-端中的S27被AKT等關(guān)鍵信號(hào)激酶磷酸化，使該酶失活。在作者的METTL1-WDR4tRNA-SAH結(jié)構(gòu)中，S27位于SAH和RNA主鏈之間，最靠近U20的磷酸基(~5A)。S27的磷酸化很可能由于空間碰撞和電荷排斥而產(chǎn)生碰撞(圖5g)。事實(shí)上，當(dāng)作者使用METTL1S27E模擬磷酸化時(shí)，作者觀察到體外甲基化活性顯著降低(圖5h)。當(dāng)作者截?cái)?span>METTL1的前19個(gè)氨基酸時(shí)，有類似的酶活性損失，突出了METTL1 N-端對(duì)生產(chǎn)甲基化的積極貢獻(xiàn)。大多數(shù)tRNA對(duì)METTL1 N-端的截?cái)嗷蛲蛔兒苊舾?。然而，敏感程度各不相同，某?span>tRNA(如tRNACys和tRNATrp)不受相同程度的影響，而其他tRNAVal(如tRNAVal)對(duì)n項(xiàng)的變化反應(yīng)更靈敏。總之，作者的數(shù)據(jù)表明，METTL1的N端調(diào)控m7G 46甲基化活性，它通過協(xié)調(diào)SAM結(jié)合、RNA結(jié)合以及tRNA和METTL1-WDR4的構(gòu)象變化而起作用，在結(jié)合輔因子和tRNA之間變得有序。同時(shí)，催化環(huán)向tRNA延伸，WDR4 C端螺旋對(duì)METTL1 N端呈剛性，以加強(qiáng)對(duì)外部tRNA肘部的控制。同樣的METTL1 N-端也通過取代螺旋核中的G46(通過R24)激活tRNA，釋放鳥嘌呤翻轉(zhuǎn)并插入含有SAM和三個(gè)對(duì)催化至關(guān)重要的酸性殘基的活性位點(diǎn)，在N7位置進(jìn)行甲基化。當(dāng)可變環(huán)展開時(shí)，序列rgg46y可能有助于定位修改后的堿基的最佳位置。METTL1 N端的截?cái)嗷蛐揎?span>(如S27的磷酸化)抑制了催化口袋的正常組織，這為m7G修飾如何在翻譯后調(diào)節(jié)提供了結(jié)構(gòu)解釋。有趣的是，METTL1 N端僅調(diào)控tRNA的一個(gè)子集。因此，通過不同背景下METTL1的分子快照，作者闡明了METTL1特異性甲基轉(zhuǎn)移酶功能和調(diào)控的機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)方法

       蛋白表達(dá)與純化；蛋白質(zhì)結(jié)晶；X結(jié)晶衍射分析；RNA體外轉(zhuǎn)錄；體外甲基化試驗(yàn)；電泳遷移率轉(zhuǎn)移試驗(yàn)；低溫電鏡樣品制備和數(shù)據(jù)收集