膠質(zhì)瘤來源的ANXA1通過促進(jìn)抗炎腫瘤微環(huán)境抑制對(duì)TLR3配體的免疫應(yīng)答

       高度免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）和血腦屏障的存在是高級(jí)別膠質(zhì)瘤（HGG）患者誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答的兩大障礙。在本注冊(cè)臨床試驗(yàn)（NCT03392545）中，作者試圖通過顱內(nèi)注射poly（I:C）增強(qiáng)復(fù)發(fā)性HGG患者的局部固有免疫應(yīng)答，以建立強(qiáng)大的抗腫瘤免疫應(yīng)答。在隨訪過程中，12例（44.4%）患者達(dá)到腫瘤控制和生存獲益，被認(rèn)為是本研究的反應(yīng)者。作者發(fā)現(xiàn)poly（I:C）處理后，TME中的T細(xì)胞受體（TCR）譜發(fā)生了重塑。基于腫瘤樣本的RNA-seq分析，膜聯(lián)蛋白A1（ANXA1）在無反應(yīng)患者的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，并在蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，ANXA1通過其表面受體甲酰肽受體1（FPR1）誘導(dǎo)M2樣巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，建立Treg細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的免疫抑制性TME，并抑制poly（I:C）促進(jìn)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。ANXA1/FPR1信號(hào)軸可通過促進(jìn)抗炎和Treg驅(qū)動(dòng)的TME抑制膠質(zhì)瘤患者的固有免疫反應(yīng)。ANXA1可作為poly（I:C）治療反應(yīng)的可靠預(yù)測(cè)因子，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)92.3%。鑒于這些顯著的發(fā)現(xiàn)，本研究揭示了膠質(zhì)瘤免疫治療的新視角。本文于2023年12月發(fā)表于《Cellular & molecular immunology》，IF: 24.1；Q1。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、HGG患者的治療和預(yù)后

       本研究納入了一個(gè)包含27例患者的隊(duì)列。在術(shù)前和術(shù)后階段進(jìn)行了全面的采樣程序，以獲取腫瘤樣本、腦脊液（CSF）和外周血（圖1A）。從北京天壇醫(yī)院獲取患者的基因及臨床資料。

       在27例患者中，1例（3.7%）達(dá)到完全緩解（CR），9例（33.3%）達(dá)到部分緩解（PR），2例（7.4%）達(dá)到疾病穩(wěn)定（SD），15例（55.6%）達(dá)到疾病進(jìn)展（PD），因此疾病控制率為44.4%（圖1B）。將達(dá)到CR、PR或SD的患者定義為有反應(yīng)者，而出現(xiàn)PD的患者定義為無反應(yīng)者。有反應(yīng)者的中位無進(jìn)展生存期和總生存期分別為221.0天和441.0天，顯著長(zhǎng)于無反應(yīng)者（P < 0.05）（圖1C和D）。

圖1 免疫佐劑poly（I:C）治療為應(yīng)答者提供了生存獲益

2、應(yīng)答者的CSF和TILs中存在CTLs的優(yōu)勢(shì)寡克隆

       為了評(píng)估poly（I:C）治療后反應(yīng)組和無反應(yīng)組患者TME中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs）增殖的潛在差異，作者分析了兩組患者在poly（I:C）治療前后CSF、外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）的TCR譜模式。發(fā)現(xiàn)CSF中可能發(fā)生了一些優(yōu)勢(shì)克隆的擴(kuò)增，最終導(dǎo)致CSF中細(xì)胞數(shù)量增加，而不影響TCR克隆型。

       進(jìn)一步分析各組間CSF和PBLs中所有克隆型TCRs的比例。CSF內(nèi)TCR多樣性的變化顯示出有應(yīng)答組和無應(yīng)答組之間的顯著差異，而這一趨勢(shì)在PBLs分析中消失（圖2A）。在應(yīng)答者的CSF中，占總克隆空間5%以上的超擴(kuò)增克隆型特異性富集（圖2B）。作者進(jìn)一步分析了前10個(gè)TCR克隆在應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間的比例，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增最多的克隆型在應(yīng)答者CSF中占據(jù)了顯著更大的克隆空間百分比（圖2C）。正如預(yù)期的那樣，部分CTL克隆在CSF和TILs中強(qiáng)勁增殖發(fā)生于有應(yīng)答者，而非無應(yīng)答者（圖2D）。此外，在接受poly（I:C）治療后，高度豐富的克隆型僅在有應(yīng)答者的TILs中顯著富集，而在無應(yīng)答者的TILs中未顯著富集（圖2E），這表明局部腫瘤中的T細(xì)胞庫(kù)發(fā)生了重塑。

圖2 對(duì)poly（I:C）應(yīng)答組和無應(yīng)答組之間配對(duì)CSF和PBL樣本的TCR多樣性分析

3、無應(yīng)答者的TME以Treg細(xì)胞為主

       由于應(yīng)答者表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)的CTL增殖，作者使用scRNA-seq和配對(duì)TCR-seq擴(kuò)展了TILs中CD45+免疫細(xì)胞的特征。作者最初通過無監(jiān)督聚類法在2個(gè)樣本中識(shí)別出10個(gè)不同的T細(xì)胞簇（圖3A）。CD8+和CD4+ T細(xì)胞表現(xiàn)為表達(dá)na?ve標(biāo)志物（SELL和CCR7）、活化效應(yīng)標(biāo)志物（GZMA、GZMH和GZMK）或耗竭標(biāo)志物（PDCD1和HAVCR2）的亞群。此外，Treg細(xì)胞表達(dá)CD4和FOXP3（圖3B）。接下來的聚類分析表明，無應(yīng)答者的TCR克隆主要是CD4+ Treg細(xì)胞和耗竭的CD4+細(xì)胞，而有應(yīng)答者的TCR克隆主要是記憶性和效應(yīng)性T細(xì)胞（圖3C）。作者進(jìn)一步將免疫細(xì)胞分為三個(gè)主要亞組（Treg細(xì)胞、非Treg CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在無應(yīng)答者的腫瘤中占優(yōu)勢(shì)，而CD8+細(xì)胞在有應(yīng)答者的腫瘤中富集（圖3D）。有趣的是，根據(jù)治療前后樣本中TCR比率的變化，結(jié)合從緩解后復(fù)發(fā)腫瘤中獲得的scRNA-seq數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)，在無反應(yīng)者的治療后腫瘤中比例增加的克隆最終退化為耗竭和Treg CD4+細(xì)胞（圖3E）。而緩解組患者治療后腫瘤中高比例和遞減比例的克隆主要為CTLs，且多為復(fù)發(fā)后的效應(yīng)性、記憶性和耗竭性CD8+細(xì)胞（圖3F）。這些結(jié)果表明，無應(yīng)答患者增加的Treg細(xì)胞產(chǎn)生了免疫抑制性TME。

圖3 scRNA-seq分析揭示無應(yīng)答者保留了以Treg細(xì)胞為主的腫瘤微環(huán)境

4、無應(yīng)答者可促進(jìn)過度炎癥性TME

       為進(jìn)一步研究產(chǎn)生這種不同治療應(yīng)答的原因，并確定對(duì)poly（I:C）產(chǎn)生應(yīng)答的預(yù)測(cè)因素，作者對(duì)應(yīng)答者和無應(yīng)答者的6個(gè)治療前樣本的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序。對(duì)差異表達(dá)基因的功能富集分析顯示，在無應(yīng)答者中，許多參與適應(yīng)性和固有免疫的免疫相關(guān)基因模塊上調(diào)（圖4A和B）。此外，無應(yīng)答者中大多數(shù)下調(diào)的模塊與神經(jīng)發(fā)育功能相關(guān)（圖4C和D）。

       為了更好地了解無應(yīng)答患者的特征，作者系統(tǒng)分析了癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中作為對(duì)照的5例癌旁正常組織（GBM）樣本、2例有應(yīng)答的復(fù)發(fā)患者樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和既往測(cè)序數(shù)據(jù)。綜合分析表明，治療前應(yīng)答組樣本的基因表達(dá)模式與癌旁組樣本相似，而復(fù)發(fā)應(yīng)答組樣本的特征介于應(yīng)答組和無應(yīng)答組之間（圖4E-G）。這一發(fā)現(xiàn)提示了患者從免疫應(yīng)答到無應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄特征逐漸轉(zhuǎn)化。值得注意的是，與其他患者的樣本相比，在無應(yīng)答者的樣本中，免疫相關(guān)模塊顯著上調(diào)（圖4F）。這些發(fā)現(xiàn)提示無反應(yīng)患者的TME與過度激活和過度炎癥相關(guān)。

圖4 應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間轉(zhuǎn)錄組譜的差異

5、ANXA1是TLR3配體應(yīng)答的潛在預(yù)測(cè)因子

       通過差異表達(dá)分析，作者確定了上調(diào)或下調(diào)的前20個(gè)差異表達(dá)基因（圖4H）。通過定量PCR驗(yàn)證，作者發(fā)現(xiàn)有應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間的ANXA1水平顯著不同（圖5A）。因此，作者后續(xù)的分析集中在ANXA1上。通過比較ANXA1在4組（癌旁組、無應(yīng)答組、有應(yīng)答組和有應(yīng)答的復(fù)發(fā)組）中的表達(dá)水平，作者發(fā)現(xiàn)ANXA1在無應(yīng)答組中表達(dá)最高，其次是在正常組和有應(yīng)答組中表達(dá)較低（圖5B）。免疫組化數(shù)據(jù)還表明，ANXA1在無應(yīng)答者的腫瘤中高表達(dá)，并且其表達(dá)在應(yīng)答組中非常低，但在復(fù)發(fā)組中升高（圖5C）。此外，作者根據(jù)TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)添加了數(shù)百個(gè)膠質(zhì)瘤腫瘤和對(duì)照正常組織之間的樣本中ANXA1的表達(dá)。分析結(jié)果顯示，ANXA1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平顯著高于正常組織。通過回顧性分析接受poly（I:C）治療的患者中ANXA1蛋白的表達(dá)，探討ANXA1作為TLR3配體治療應(yīng)答預(yù)測(cè)因子的有效性。作者的結(jié)果表明，有應(yīng)答者的ANXA1表達(dá)顯著低于無應(yīng)答者。受試者工作特征（ROC）曲線顯示，ANXA1預(yù)測(cè)TLR3配體應(yīng)答的敏感度、特異度和準(zhǔn)確度分別為91.7%、92.9%和92.3%（圖5D）。

圖5 膠質(zhì)瘤源性ANXA1誘導(dǎo)M2樣巨噬細(xì)胞募集Treg細(xì)胞

6、ANXA1可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化

       雖然ANXA1在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但根據(jù)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，腫瘤細(xì)胞是應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間不同表達(dá)模式的主要來源（圖5E）。FPR1作為ANXA1的主要受體，主要表達(dá)于無應(yīng)答的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞（圖5F）。這些結(jié)果提示腫瘤中巨噬細(xì)胞可能通過分泌一些趨化因子來招募Treg細(xì)胞。因此，作者通過單細(xì)胞RNA-seq測(cè)定了巨噬細(xì)胞中CCL22的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)答樣本中的CCL22表達(dá)顯著高于無應(yīng)答樣本（圖5G）。既往研究表明M2型巨噬細(xì)胞募集更多的Treg細(xì)胞，因此作者評(píng)估了M2型相關(guān)基因在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。根據(jù)M1（IL6、IL1B、IL12B、CD86、CXCL9、CXCL10、IFNB1、IFNAR1和TNF）和M2（IL10、CCL22、ARG1、MRC1、CD163、MRC1、TGFB1、IRF4、TGM2、CXCL12和CXCR4）標(biāo)記基因，作者對(duì)單細(xì)胞RNA-seq中的每個(gè)巨噬細(xì)胞進(jìn)行了評(píng)分，并證實(shí)無應(yīng)答（P1）樣本中的巨噬細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的M2表型（圖5H）。

       這一與腫瘤-巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞-Treg關(guān)系相關(guān)的見解促使作者探索ANXA1在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化中的作用。在U251細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，通過檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD163和CD206的表達(dá)來評(píng)估其M2型表型。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與U251-ANXA1High膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)組的M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量高于與U251-ANXA1Low膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)組。這些結(jié)果共同支持ANXA1在觸發(fā)巨噬細(xì)胞M2表型極化中發(fā)揮關(guān)鍵作用的結(jié)論（圖5I）。此外，與未處理的巨噬細(xì)胞相比，重組人類ANXA1處理的巨噬細(xì)胞釋放更高水平的CCL22，而poly（I:C）顯著抑制ANXA1的誘導(dǎo)并進(jìn)一步降低巨噬細(xì)胞中CCL22的表達(dá)。加入FPR1抑制劑HCH6-1可抑制ANXA1誘導(dǎo)的CCL22水平升高（圖5J）。

       為了驗(yàn)證ANXA1/FPR1軸在腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間募集Treg細(xì)胞的功能，作者進(jìn)行了Treg趨化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明ANXA1處理的M2巨噬細(xì)胞比未處理的M2巨噬細(xì)胞募集更多的Treg細(xì)胞（圖5K）。這些結(jié)果表明ANXA1可以顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞募集Treg細(xì)胞的能力。

       此外，poly（I:C）刺激后，M0細(xì)胞中TLR3的mRNA表達(dá)顯著激活，加入FPR1抑制劑HCH6-1后，激活效率無明顯影響，但ANXA1與poly（I:C）共存導(dǎo)致TLR3下調(diào)（圖5L）。這一結(jié)果表明ANXA1通過下調(diào)其受體TLR3的表達(dá)來抑制對(duì)poly（I:C）的應(yīng)答。

圖6 膠質(zhì)瘤中ANXA1的低表達(dá)與原位腫瘤小鼠對(duì)TLR3配體的有效反應(yīng)相關(guān)

7、降低ANXA1的表達(dá)可提高對(duì)TLR3配體的應(yīng)答

       作者使用GL261細(xì)胞建立原位腫瘤小鼠模型，研究ANXA1對(duì)TLR3配體的直接影響。對(duì)小鼠進(jìn)行Poly（I:C）免疫治療。作者對(duì)腫瘤進(jìn)行了RNAseq分析，發(fā)現(xiàn)poly（I:C）應(yīng)答小鼠的ANXA1表達(dá)水平相對(duì)較低，這與正常小鼠腦組織中的ANXA1表達(dá)水平相似（圖6A）。為了確定該模型小鼠原位腫瘤中的腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞類型，作者分析了來自小鼠樣本的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與無應(yīng)答小鼠的腫瘤相比，CD8細(xì)胞在有應(yīng)答小鼠的腫瘤中顯著富集。相反，無應(yīng)答小鼠的Treg細(xì)胞水平高于有應(yīng)答小鼠（圖6B和C）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ANXA1和TLR3配體之間的關(guān)聯(lián)，作者使用GL261-ANXA1WT-luc和GL261-ANXA1KD-luc細(xì)胞在小鼠中產(chǎn)生原位腫瘤，并給予poly（I:C）（圖6D）。GL261-ANXA1WT-luc細(xì)胞較GL261-ANXA1KD-luc細(xì)胞誘導(dǎo)更多的實(shí)質(zhì)性腫瘤進(jìn)展。此外，腫瘤中ANXA1的低表達(dá)導(dǎo)致了對(duì)poly（I:C）的有效應(yīng)答，顯示了強(qiáng)大的腫瘤控制能力（圖6E和F）。此外，作者在所有實(shí)驗(yàn)小鼠中進(jìn)行了生存分析，結(jié)果顯示，接受poly（I:C）的ANXA1KD小鼠的生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于未注射poly（I:C）的ANXA1WT小鼠（P < 0.01）（圖6G）。雖然這些小鼠在第20天被殺死，但四組小鼠的生存趨勢(shì)仍然可以為干預(yù)的效果提供有價(jià)值的見解。作者分析了小鼠原位腫瘤的TILs，發(fā)現(xiàn)在poly（I:C）處理后，GL261-ANXA1KD-luc小鼠比GL261-ANXA1WT-luc小鼠激活了更多的CD8細(xì)胞。相反，在GL261-ANXA1WT-luc小鼠的腫瘤中，Treg細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞的水平高于GL261-ANXA1KD-luc小鼠的腫瘤（圖6H）。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)與多色IF染色結(jié)果一致（圖6I）。因此，作者的數(shù)據(jù)表明，ANXA1水平較低的腫瘤對(duì)TLR3配體有更有效的應(yīng)答。

結(jié)論：

       在本研究中，作者證明了膠質(zhì)瘤來源的ANXA1對(duì)體內(nèi)TLR3配體應(yīng)答有重要影響，通過ANXA1/FPR1軸使巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞向M2樣表型傾斜，促進(jìn)免疫抑制性TME的發(fā)展。作者的發(fā)現(xiàn)為ANXA1在膠質(zhì)瘤生物學(xué)中的功能提供了更多的機(jī)制見解。首先，作者發(fā)現(xiàn)，如在對(duì)poly（I:C）有應(yīng)答的患者中觀察到的那樣，無應(yīng)答者在CSF或TILs中均不具有優(yōu)勢(shì)寡克隆的特征。其次，作者發(fā)現(xiàn)在無反應(yīng)的TME中，高炎癥和免疫抑制的TME伴隨著ANXA1的高表達(dá)被促進(jìn)。第三，作者發(fā)現(xiàn)ANXA1高表達(dá)可以觸發(fā)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，增強(qiáng)Treg細(xì)胞浸潤(rùn)，降低患者和膠質(zhì)瘤模型小鼠的生存率。作者的結(jié)果揭示了膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過ANXA1/FPR1軸調(diào)節(jié)腦腫瘤環(huán)境的機(jī)制，并有助于TLR3配體的治療抵抗。

       綜上所述，作者提出了以下模型（圖7）:在無應(yīng)答膠質(zhì)瘤中，ANXA1的高表達(dá)與巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中FPR1的高表達(dá)相關(guān)，后者可以通過趨化釋放抗炎細(xì)胞因子來招募Treg細(xì)胞;因此，以Treg細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞群建立了免疫抑制性TME。與此模型一致，TME抑制了poly（I:C）的免疫激活，臨床表現(xiàn)為對(duì)poly（I:C）的抵抗。ANXA1被認(rèn)為是一個(gè)可靠的預(yù)測(cè)對(duì)TLR3配體反應(yīng)的指標(biāo)，因?yàn)樗谀[瘤組織樣本中有應(yīng)答和無應(yīng)答之間的差異表達(dá)。從臨床角度來看，評(píng)估TLR3配體（如poly（I:C））的治療效用可能是有趣的，同時(shí)重點(diǎn)關(guān)注通過穿刺活檢確定的膠質(zhì)瘤腫瘤組織中ANXA1表達(dá)水平與癌旁組織相似或略低的患者人群。這種方法有助于制定個(gè)性化的免疫治療方案。對(duì)于無應(yīng)答者，FPR1阻滯劑可能克服poly（I:C）耐藥，但仍需要臨床試驗(yàn)的支持。探索和了解ANXA1在膠質(zhì)瘤生物學(xué)中的分子機(jī)制，可拓寬TLR3配體應(yīng)答者的靶人群，改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。

圖7 在膠質(zhì)瘤的TME中，ANXA1/FPR1軸和TLR3配體觸發(fā)了抗腫瘤免疫應(yīng)答

實(shí)驗(yàn)方法：

       制備單細(xì)胞懸浮液；CD8+CTLs TCR庫(kù)的建立與分析；單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和scRNA-seq數(shù)據(jù)處理；TCR測(cè)序（TCR-seq）數(shù)據(jù)處理；細(xì)胞間相互作用；RNA-seq數(shù)據(jù)分析及富集分析；組織切片和免疫組化（IHC）；免疫熒光（IF）；細(xì)胞系和培養(yǎng)條件；流式細(xì)胞術(shù)；趨化性實(shí)驗(yàn)；小鼠模型。

參考文獻(xiàn)：

       Zheng Y, Jiang H, Yang N, Shen S, Huang D, Jia L, Ling J, Xu L, Li M, Yu K, Ren X, Cui Y, Lan X, Lin S, Lin X. Glioma-derived ANXA1 suppresses the immune response to TLR3 ligands by promoting an anti-inflammatory tumor microenvironment. Cell Mol Immunol. 2023 Dec 4. doi: 10.1038/s41423-023-01110-0. Epub ahead of print. PMID: 38049523.