神經(jīng)節(jié)苷脂GM3通過抑制血管平滑肌細(xì)胞鐵死亡預(yù)防腹主動脈瘤

         腹主動脈瘤（AAA）是一種潛在的危及生命的血管疾病，但目前缺乏經(jīng)批準(zhǔn)的藥物治療來防止AAA的進(jìn)展和破裂。鞘脂代謝紊亂與AAA的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM3（一種含唾液酸型鞘脂糖）對動脈粥樣硬化具有保護(hù)作用，是AAA發(fā)生的重要危險因素;然而，GM3對AAA發(fā)展的潛在貢獻(xiàn)尚未得到調(diào)查。作者進(jìn)行了一項代謝組學(xué)研究，以評估人類AAA患者血漿中的GM3水平。作者通過Western blotting和免疫熒光染色分析了GM3合成酶（ST3GAL5）在小鼠動脈瘤模型和人類AAA組織中的表達(dá)。通過RNA測序、親和純化和質(zhì)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)分析、表面等離子體共振分析和功能研究，解析GM3調(diào)控鐵死亡的分子機(jī)制。作者在體內(nèi)的平滑肌細(xì)胞（SMCs）中有條件地刪除和過表達(dá)St3gal5，以研究其在AAA中的作用。作者發(fā)現(xiàn)，人類腹主動脈瘤患者的血漿GM3水平顯著降低。腹主動脈血管平滑肌細(xì)胞GM3含量和ST3GAL5表達(dá)在腹主動脈瘤患者和腹主動脈瘤小鼠模型中降低。RNA測序分析表明，沉默ST3GAL5可誘導(dǎo)人主動脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。作者發(fā)現(xiàn)GM3直接與TFR1（轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1）的胞外結(jié)構(gòu)域相互作用，并破壞其與全轉(zhuǎn)鐵蛋白的相互作用。TFR1是細(xì)胞攝取鐵的關(guān)鍵細(xì)胞膜蛋白。SMC特異性St3gal5敲除加重了病變部位的鐵沉積，顯著促進(jìn)了小鼠AAA的發(fā)展，而GM3補(bǔ)充抑制了脂質(zhì)過氧化，減少了主動脈平滑肌細(xì)胞的鐵沉積，顯著降低了AAA的發(fā)病率。綜上所述，GM3失調(diào)可促進(jìn)AAA血管平滑肌細(xì)胞鐵死亡，GM3可能成為治療AAA的新靶點(diǎn)。本文于2023年11月發(fā)表于《Circulation》，IF:37.8，Q1。

技術(shù)路線：

主要實驗結(jié)果：

1、GM3在人和小鼠腹主動脈瘤中表達(dá)下調(diào)

         為了探討AAA患者鞘脂水平的變化，作者采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）對100名AAA患者和100名對照組的血漿進(jìn)行了靶向代謝組學(xué)分析研究。正交偏最小二乘-判別分析的評分圖表明，人AAA的鞘脂譜發(fā)生了顯著改變（圖1A），而投影評分圖中的變量重要性確定GM3分子是導(dǎo)致組間差異的前3個變量（圖1B）。進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)（熱圖和火山圖）證實，GM3水平在AAA中顯著降低（圖1C和1D）。此外，GM3血漿濃度較低與AAA風(fēng)險增加相關(guān)（圖1E）。在100例AAA患者中，4種GM3類型（GM3 16:0、GM3 18:0、GM3 20:0和GM3 22:0）的水平顯著低于100例對照（圖1F）。作者還通過LC-MS/MS分析了GM3在AAA和AngII處理ApoE?/?小鼠模型中的水平。結(jié)果表明，AngII治療小鼠的病變中GM3水平低于鹽水治療對照（圖1G）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明GM3在人和小鼠腹主動脈瘤中表達(dá)下調(diào)，并且可能在腹主動脈瘤中起重要作用。

圖1 AAA患者和小鼠AAA病變血漿中GM3水平降低

2、下調(diào)ST3GAL5導(dǎo)致VSMCs中GM3水平降低促進(jìn)AAA進(jìn)展

         鑒于VSMC功能障礙是AAA的主要病理特征，作者進(jìn)一步通過免疫熒光染色比較了AAA患者和小鼠模型腹主動脈VSMCs中GM3的含量。結(jié)果顯示，腹主動脈瘤患者腹主動脈VSMCs的GM3水平顯著降低（7倍），而接受AngII治療的ApoE - / -小鼠腹主動脈GM3水平顯著降低（5倍;圖2A-2C）。這些結(jié)果證明VSMCs中GM3水平降低與AAA疾病進(jìn)展密切相關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)GM3降低了AAA發(fā)生率（圖2D和2E）和彈性蛋白破裂程度（圖2F）。這些結(jié)果表明，GM3可能對腹主動脈瘤有潛在的治療作用。接下來，作者想研究可能導(dǎo)致GM3水平變化的酶。ST3GAL5將乳糖神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化為GM3，而GM3可被ST8SIA1和B4GALNT1進(jìn)一步催化，分別形成GM2和GD3（圖2G）。作者的數(shù)據(jù)表明，ST3GAL5在人AAA組織和AngII處理的ApoE - / -小鼠主動脈動脈瘤的蛋白質(zhì)水平顯著下調(diào)（圖2H和2I）。作者還發(fā)現(xiàn)，在AAA患者和小鼠AAA病變的VSMCs中，ST3GAL5水平顯著降低（圖2J-2L）。這些結(jié)果證實了ST3GAL5是GM3的關(guān)鍵酶調(diào)節(jié)因子，并在AAA進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

圖2 T3GAL5在人和小鼠AAA中下調(diào)

3、GM3調(diào)節(jié)人主動脈平滑肌細(xì)胞鐵平衡和鐵死亡

         為了了解GM3如何影響血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞過程，作者對轉(zhuǎn)染ST3GAL5 siRNA （siST3GAL5）或?qū)φ?span>siRNA （siNC）的人主動脈平滑肌細(xì)胞（HASMCs）進(jìn)行了RNA測序（圖3A）。差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析突出了細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期、自噬和鐵死亡等細(xì)胞過程（圖3B）。同時，感染siST3GAL5的HASMCs細(xì)胞死亡增加。只有鐵死亡抑制劑ferrostain-1顯著地抑制了ST3GAL5敲低引起的細(xì)胞死亡增加，而壞死、凋亡和自噬抑制劑necrostain-1、emricasan或氯喹均無這一作用（圖3C），這意味著GM3主要影響HASMC鐵死亡。這些結(jié)果表明，鐵死亡的過程，包括鐵超載，SMC谷胱甘肽消耗和脂質(zhì)過氧化，在AAA的發(fā)展過程中發(fā)生。

         同樣，沉默ST3GAL5的HASMCs表現(xiàn)出明顯的鐵死亡特征。相對于對照細(xì)胞的水平，在siST3GAL5轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，脂質(zhì)活性氧（ROS）生成、丙二醛生成、細(xì)胞內(nèi)總鐵和Fe2+顯著增加，而谷胱甘肽水平顯著降低（圖3D-3I）。接下來，由于研究發(fā)現(xiàn)ST3GAL5敲除可誘導(dǎo)HASMCs發(fā)生鐵死亡，因此作者研究了ST3GAL5過表達(dá)在鐵死亡誘劑咪唑酮抹去素處理的HASMCs中減輕鐵死亡的能力。正如預(yù)期的那樣，ST3GAL5過表達(dá)顯著抑制了咪唑酮抹去素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖3J和3K）。ST3GAL5過表達(dá)還部分阻斷了咪唑酮抹去素誘導(dǎo)的脂質(zhì)ROS生成增加、丙二醛生成和鐵負(fù)荷增加，以及谷胱甘肽水平降低（圖3L-3Q）。值得注意的是，在基礎(chǔ)條件下，ST3GAL5過表達(dá)對HASMCs中的谷胱甘肽和丙二醛水平、脂質(zhì)ROS生成或死亡沒有影響（圖3J-3N），但總鐵和Fe2+被輕度下調(diào)（圖3O-3Q）。因此，作者推測GM3缺失可能通過影響平滑肌細(xì)胞的鐵沉積來誘導(dǎo)鐵死亡?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，GM3主要通過鐵死亡介導(dǎo)的機(jī)制影響SMC的死亡。

圖3 GM3調(diào)節(jié)HASMCs的鐵死亡

4、GM3通過與TFR1結(jié)合調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的鐵穩(wěn)態(tài)

         在確定GM3影響平滑肌細(xì)胞的鐵水平后，作者研究了GM3是否影響細(xì)胞外不穩(wěn)定鐵的水平。不穩(wěn)定鐵池被認(rèn)為是由受細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的松散結(jié)合的氧化還原活性鐵組成的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室。高水平的不穩(wěn)定鐵已被證明會促進(jìn)氧化應(yīng)激。用鈣黃綠素- AM（與鐵結(jié)合后淬滅的熒光探針）通過流式細(xì)胞術(shù)分析HASMCs中不穩(wěn)定的鐵。敲低ST3GAL5導(dǎo)致的GM3缺失導(dǎo)致不穩(wěn)定鐵池顯著增加，而這種作用被GM3的加入所緩解;此外，ST3GAL5過表達(dá)顯著減少了不穩(wěn)定鐵池（圖4A）。接下來，作者探索了GM3影響細(xì)胞內(nèi)鐵含量的機(jī)制。GM3是一種細(xì)胞膜脂質(zhì)，由位于細(xì)胞膜外葉的脂質(zhì)部分和突出于細(xì)胞外間隙的碳水化合物鏈組成。因此，GM3已被證明與膜受體結(jié)合并影響受體信號傳導(dǎo)。作者推測GM3與某些膜蛋白的結(jié)合可能直接或間接影響細(xì)胞內(nèi)的鐵含量。為了確定HASMCs中潛在的結(jié)合伴侶，作者使用親和鏈霉親和素T1珠粒將與生物素標(biāo)記的GM3結(jié)合的蛋白拉下來，并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖4B和4C）。在篩選出的15個GM3相互作用的候選膜蛋白中（圖4D），TFR1可能與GM3對細(xì)胞內(nèi)鐵含量的影響有關(guān)。質(zhì)膜上的全轉(zhuǎn)錄因子與TFR1結(jié)合，然后通過核內(nèi)體內(nèi)化，介導(dǎo)了細(xì)胞外鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。表面等離子體共振分析表明GM3和TFR1胞外結(jié)構(gòu)域之間存在相互作用（圖4E）。作者還發(fā)現(xiàn)，GM3水平降低（在ST3GAL5敲低的細(xì)胞中）顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的鐵攝取，而補(bǔ)充GM3后，細(xì)胞的鐵攝取受到抑制（圖4F）。競爭性表面等離子體共振實驗證實，GM3抑制了全轉(zhuǎn)錄因子和TFR1胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合（圖4G）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析鏈霉親和素/FITC與生物素-全轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合表明，GM3的缺失導(dǎo)致全轉(zhuǎn)錄因子和TFR1的結(jié)合增加，主要在細(xì)胞膜上;添加GM3逆轉(zhuǎn)了這一增加（圖4H）。鄰近實驗顯示，在ST3GAL5敲低的細(xì)胞中，TFR1和全轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)顯著增加（3倍）。將GM3重新引入這些細(xì)胞可抑制上述增加（圖4I和4J）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，GM3水平降低促進(jìn)了TFR1與核內(nèi)體調(diào)節(jié)因子RAB5的結(jié)合，導(dǎo)致含鐵的核內(nèi)體囊泡形成增加（圖4K和圖4L）。TFR1敲低恢復(fù)了siST3GAL5的作用，包括降低脂質(zhì)ROS水平，以及增加細(xì)胞死亡、總鐵和Fe2+水平（圖4M-4P）。因此，作者得出結(jié)論，GM3通過干擾TFR1和holo- Tf之間的相互作用在鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。

圖4 低GM3水平通過增強(qiáng)TFR1和holo-Tf相互作用誘導(dǎo)鐵攝取增加

5、KLF9的缺失通過增強(qiáng)H3k27ac和招募Pol II促進(jìn)ST3GAL5的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)

         在闡明了GM3在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用后，作者進(jìn)一步探索了ST3GAL5改變AAA的潛在機(jī)制，如轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。H3K27ac （HiChIP）監(jiān)管相互作用數(shù)據(jù)庫（GEO;https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/）揭示了HASMCs中ST3GAL5啟動子和遠(yuǎn)端增強(qiáng)子之間的相互作用（圖5A和5B）。Ma等人最近通過H3K27ac HiChIP數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了KLF家族轉(zhuǎn)錄因子在AAA中的關(guān)鍵作用。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)KLF家族轉(zhuǎn)錄因子KLF5、KLF6、KLF9、KLF10、KLF11和KLF16的推測結(jié)合位點(diǎn)位于ST3GAL5啟動子/增強(qiáng)子（GeneCards數(shù)據(jù)庫;https://genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ST3GAL5）。定量聚合酶鏈反應(yīng)分析表明，KLF9（一個眾所周知的轉(zhuǎn)錄抑制因子）的敲低誘導(dǎo)ST3GAL5 mRNA水平顯著增加。相反，敲低其他5個KLF家族成員對ST3GAL5的轉(zhuǎn)錄沒有影響（圖5C）。染色體構(gòu)象捕獲聚合酶鏈反應(yīng)分析顯示，siKLF9增強(qiáng)了ST-3GAL5的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域之間的相互作用（圖5D）。接下來，作者通過CUT&RUN qPCR分析KLF9敲低后ST3GAL5調(diào)控區(qū)域中KLF9順式結(jié)合位點(diǎn)的變化。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siKLF9后，KLF9與ST3GAL5的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域的結(jié)合顯著減弱，同時H3K27ac和Pol II結(jié)合顯著富集（圖5E-5G）?？傊?，這些數(shù)據(jù)提示，KLF9通過阻礙H3k27ac修飾和Pol II募集來抑制ST3GAL5的近端啟動子和遠(yuǎn)端增強(qiáng)子之間的相互作用（圖5H）。細(xì)胞中KLF9敲低也誘導(dǎo)ST3GAL5蛋白水平顯著增加（4倍;圖5I和5J）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，作者發(fā)現(xiàn)在AngII誘導(dǎo)的小鼠腹主動脈病變（圖5K）和人類AAA患者的主動脈平滑肌細(xì)胞（圖5L和圖5M）中，KLF9蛋白水平顯著升高。因此，作者的數(shù)據(jù)表明KLF9抑制ST3GAL5在AAA中的表達(dá)。

圖5 KLF9在AAA中表達(dá)上調(diào)，KLF9敲低可通過增加增強(qiáng)子-啟動子相互作用促進(jìn)ST3GAL5轉(zhuǎn)錄

6、在體內(nèi)平滑肌細(xì)胞中St3gal5表達(dá)增加可抑制AngII誘導(dǎo)的AAA

         為了探索GM3對體內(nèi)AAA的治療潛力，作者使用腺相關(guān)病毒St3gal5 （AAV-St3gal5）或腺相關(guān)病毒增效綠色熒光蛋白（AAV-EGFP）感染ApoE - / -小鼠的腎上腹主動脈節(jié)段30日（通過外膜周給藥），之后輸入AngII 28日（圖6A）。在感染AAV-St3gal5或AAV-EGFP的鹽水輸入小鼠中，未發(fā)生AAA（圖6C）。相反，在輸入AngII的小鼠中，與AAV-EGFP組相比，AAV-St3gal5組的生存率較高，AAA發(fā)生率和最大腹主動脈直徑較低（圖6B-6E）。病變的組織學(xué)分析顯示，在接受AngII治療的AAV-St3gal5組中，Elastica van Gieson染色顯示彈性蛋白降解減少（圖6F和6G），柏林藍(lán)染色顯示鐵蓄積顯著減少（圖6F和6H）。在AngII處理的AAV-St3gal5組中，VSMCs中的Gpx4表達(dá)也顯著增加，而4-羥基壬烯醛水平顯著降低（圖6I和圖6J）。這些結(jié)果表明，GM3通過穩(wěn)定AAA細(xì)胞內(nèi)鐵水平和減少脂質(zhì)過氧化來保護(hù)VSMCs。

         血壓是腹主動脈瘤發(fā)病的重要危險因素。例如，一項研究分析了13年期間的605例腹主動脈瘤患者，結(jié)果顯示高血壓與腹主動脈瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究表明VSMCs中St3gal5過表達(dá)可能通過減輕鐵死亡減輕小鼠AAA的發(fā)生和發(fā)展，而不是影響血壓。

圖6 VSMC特異性過表達(dá)St3gal5可減弱AngII誘導(dǎo)的小鼠AAA形成

7、SMCs中GM3缺失通過加重鐵失衡促進(jìn)AAA發(fā)展

         為了進(jìn)一步探索GM3在AAA平滑肌細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)維持中的作用，作者通過將St3gal5flox/flox ApoE?/?小鼠（St3gal5fl/fl ApoE?/?）與Myh11-CreERT2 ApoE?/?小鼠雜交，產(chǎn)生了平滑肌特異性St3gal5敲除ApoE?/?小鼠（St3gal5SMKO ApoE?/?）。作者使用他莫昔芬誘導(dǎo)產(chǎn)生的St3gal5SMKO ApoE - / -小鼠，然后輸入AngII/生理鹽水（圖7A）。在連續(xù)28日輸入AngII的St3gal5fl/fl ApoE?/?小鼠中，約60%發(fā)生AAA，而在輸入AngII的St3gal5SMKO ApoE?/?小鼠中，＞80%發(fā)生AAA。此外，St3gal5fl/fl ApoE?/?和St3gal5SMKO ApoE?/?血管灌注小鼠分別表現(xiàn)出20%和37.5%的不同死亡率（圖7B和7C）。離體分析和超聲數(shù)據(jù)證實，在輸入AngII的St3gal5SMKO ApoE - / -小鼠中，最大主動脈直徑顯著增加（圖7D, 7E）。在St3gal5SMKO ApoE?/?小鼠的病變中，彈性蛋白降解水平顯著高于St3gal5fl/fl ApoE?/?小鼠的病變（圖7F和7G）。此外，與接受AngII治療的St3gal5fl/fl ApoE?/?小鼠的病變相比，St3gal5SMKO ApoE?/?小鼠的病變中有較多的鐵蓄積（圖7F和7H），同時伴有VSMCs中4-羥基壬烯醛水平顯著升高（圖7I和7J）。最后，盡管兩個AngII治療組之間的Gpx4水平無顯著差異，但在鹽水輸入的St3gal5SMKO ApoE - / -組中，Gpx4水平顯著降低（圖7I和7J）。綜上所述，這些體內(nèi)實驗結(jié)果支持GM3在調(diào)節(jié)AAA中VSMC鐵死亡的關(guān)鍵作用。

圖7 VSMC特異性ST3GAL5缺乏通過促進(jìn)鐵失衡加重AAA形成

結(jié)論：

         作者已經(jīng)全面證明了鞘脂代謝在腹主動脈瘤中的破壞，并強(qiáng)調(diào)了VSMCs中GM3缺失對該病的促進(jìn)作用。作者的研究結(jié)果揭示了GM3能夠與細(xì)胞膜上的TFR1結(jié)合并抑制鐵的攝取，為闡明AAA中SMC鐵死亡的機(jī)制提供了新的思路。作者的研究還表明，KLF9通過轉(zhuǎn)錄抑制ST3GAL5的近端啟動子和遠(yuǎn)端增強(qiáng)子的結(jié)合來抑制GM3的合成。綜上所述，作者的結(jié)果為將GM3作為潛在的AAA治療策略提供了基礎(chǔ)。

實驗方法：

         小鼠AAA模型及治療方案；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平檢測；PI染色法；ELISA；組織學(xué)和免疫組織化學(xué)；免疫熒光染色；質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染；總RNA分離和實時定量PCR；RNA測序；WB分析；親和純化及質(zhì)樸分析；脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽和鐵含量的測量；脂質(zhì)提取和脂質(zhì)組學(xué)分析；脂質(zhì)過氧化MDA實驗；全轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)分析；Calcein-AM染色及流式細(xì)胞術(shù)分析；表面等離子體共振分析；原位接近結(jié)扎試驗；Hi-C數(shù)據(jù)分析；染色體構(gòu)象捕獲（3C）測定；剪切運(yùn)行qPCR。

參考文獻(xiàn)：

         Zhang F, Li K, Zhang W, Zhao Z, Chang F, Du J, Zhang X, Bao K, Zhang C, Shi L, Liu Z, Dai X, Chen C, Wang DW, Xian Z, Jiang H, Ai D. Ganglioside GM3 Protects Against Abdominal Aortic Aneurysm by Suppressing Ferroptosis in Vascular Smooth Muscle Cells. Circulation. 2023 Nov 29. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.066110. Epub ahead of print. PMID: 38018467.