一種針對(duì)EAG2-Kvβ2鉀通道的設(shè)計(jì)肽靶向癌細(xì)胞和神經(jīng)元的相互作用來(lái)治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤

        樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）是一種抗原呈遞骨髓細(xì)胞，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化、運(yùn)輸和功能。單核細(xì)胞來(lái)源的DCs與腫瘤抗原脈沖已廣泛用于癌癥治療性疫苗接種試驗(yàn)，臨床結(jié)果好壞參半。在這篇研究中，作者提出了一個(gè)基于小鼠或人類(lèi)DC祖細(xì)胞（DCPs）的細(xì)胞治療平臺(tái)，該平臺(tái)可以產(chǎn)生兩種免疫刺激細(xì)胞因子，IL-12和FLT3L。攜帶細(xì)胞因子的DCPs分化為傳統(tǒng)的i型DCs （cDC1）并抑制腫瘤生長(zhǎng)，包括黑色素瘤和原位肝模型，而不需要抗原負(fù)載或清骨髓宿主調(diào)節(jié)。腫瘤反應(yīng)涉及IL-12和FLT3L的協(xié)同作用，并與自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤(rùn)活化、M1巨噬細(xì)胞編程和缺血性腫瘤壞死有關(guān)?？鼓[瘤免疫依賴(lài)于內(nèi)源性cDC1擴(kuò)增和干擾素γ信號(hào)，但不需要CD8+ T細(xì)胞毒性。細(xì)胞因子武裝的DCPs與抗GD2嵌合抗原受體（CAR） T細(xì)胞有效協(xié)同根除小鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤，說(shuō)明了它們?cè)诼?lián)合治療中的潛力。本文于2023年9月發(fā)表在《Nature Cancer》，IF：22.7。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. DCPs在小鼠中產(chǎn)生cDC1

        在小鼠和人類(lèi)系統(tǒng)中，駐留在腦內(nèi)的常見(jiàn)DC祖細(xì)胞（CDPs）是罕見(jiàn)的、有前景的cDC1前體。為了獲得能夠產(chǎn)生cDC1的細(xì)胞群，作者開(kāi)發(fā)了一種從小鼠BM中體外生產(chǎn)cdp樣細(xì)胞的方案（圖1a）。這兩步過(guò)程包括造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPCs）的短期擴(kuò)增，然后在促進(jìn)cDC1譜系承諾的條件下進(jìn)行部分分化。BM細(xì)胞在含有干細(xì)胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）、FMS相關(guān)酪氨酸激酶3配體（FLT3L）、IL-3、IL-6和IL-1β（擴(kuò)增期）的HSPC培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3天。然后將漂浮細(xì)胞在含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF/CSF2）和FLT3L（分化期）的cDC1培養(yǎng)基中再培養(yǎng)4 - 5天。所得到的細(xì)胞培養(yǎng)含有類(lèi)似于CDPs的細(xì)胞（CD115+、CD11b?、CD11c?、CD103?、MHCII?、CD45R/B220?、CD117/KIT?/low和CLEEC9a?），在去除譜系陽(yáng)性細(xì)胞后，這些細(xì)胞的富集率約為30%至70%（圖1b）。與BM駐留的CDPs不同，培養(yǎng)的CDPs樣細(xì)胞不表達(dá)CLE9a；此外，它們?nèi)狈?span>CD11c和CD103，這兩種蛋白在預(yù)cDC1和成熟cDC1中表達(dá)。由于它們與自然發(fā)生的CDPs相似但不相同，作者將這些細(xì)胞稱(chēng)為DCPs。

        然后作者探索DCPs是否可以在小鼠中產(chǎn)生cDC1。作者使用CD45.1小鼠的BM細(xì)胞產(chǎn)生上述DCPs，或moDCs和成熟的cDC1樣細(xì)胞，使用既定的方案。作者在沒(méi)有事先骨髓消融的情況下，在基因CD45.2小鼠中靜脈注射每一種DC類(lèi)型（2 × 106個(gè)細(xì)胞，間隔3天），并在第二次DC劑量4天后分析受體小鼠的脾臟（圖1c）。在本實(shí)驗(yàn)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)用于識(shí)別細(xì)胞群的門(mén)控策略如圖1-6所示。與接受moDCs或cDC1樣細(xì)胞的小鼠相比，接受DCPs的小鼠脾細(xì)胞中供體來(lái)源的CD45.1+細(xì)胞的頻率更高（圖1d）。然后，作者根據(jù)早期的工作檢查了脾cDC1，發(fā)現(xiàn)cDC1內(nèi)存在大量的供體嵌合，并且在較小程度上，在接受DCPs的小鼠中，cDC2 （CD11c+CD11b+MHCII+CD8a?）（圖1e）。相反，在接受moDCs或成熟cDC1樣細(xì)胞的小鼠中，供體cDC1嵌合現(xiàn)象可以忽略不計(jì)（<0.2%）。大多數(shù)DCPs來(lái)源的細(xì)胞是cDC1， cDC2和雙陰性（CD11b - CD8a -） cDCs（圖1f）。作者還研究了BATF3（一種對(duì)cDC1發(fā)育至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子）是否在體外產(chǎn)生DCPs，以及它們?cè)谵D(zhuǎn)移到受體小鼠后的植入和分化所必需的。從CD45.2 Batf3?/?小鼠的骨髓中可以成功建立DCPs，但在轉(zhuǎn)移到CD45.1小鼠時(shí)不能移。

        接下來(lái)，作者研究了皮下MC38結(jié)直腸腫瘤小鼠中供體DCPs、moDCs和cDC1樣細(xì)胞的命運(yùn)（圖1g）。CD45.1+ DCPs來(lái)源的細(xì)胞比其他DC群體更有效地植入腫瘤和其他器官（圖1）。在腫瘤中，作者在Ly6C- F4/80- CD11c+MHCII+群體中鑒定出cDC1為CD103+CD11b-細(xì)胞，cDC2為CD103- CD11b+細(xì)胞。在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，DCPs衍生的細(xì)胞分別約占腫瘤相關(guān)cDC1和cDC2的35-45%和10%（圖1i）。DCPs對(duì)巨噬細(xì)胞等非cDC群體的貢獻(xiàn)很?。?span><1%），并且在脾臟、肺和肝臟中也能向cDC分化，而moDCs的cDC分化能力較低。綜上所述，在不需要事先的宿主調(diào)節(jié)的情況下，過(guò)繼性轉(zhuǎn)移的DCPs在腫瘤小鼠中有效地重建了cDC1，并在較小程度上重建了cDC2。

圖1 DCPs能在小鼠體內(nèi)高效生成cDCs

2. IL-12促進(jìn)DCPs分化為共刺激cDC1

        FLT3L是cDC1誘導(dǎo)和擴(kuò)增的關(guān)鍵細(xì)胞因子。作者推斷，在DCPs來(lái)源的細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)FLT3L會(huì)增加腫瘤中的內(nèi)源性cDC1。為此，作者構(gòu)建了一個(gè)慢病毒載體（LV），表達(dá)小鼠FLT3L和綠色熒光蛋白（GFP）；作為對(duì)照，作者使用僅表達(dá)GFP的LV。作者在第2天轉(zhuǎn)導(dǎo)BM來(lái)源的HSPCs，然后測(cè)量GFP表達(dá)和FLT3L分泌。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第6天有效表達(dá)GF，并強(qiáng)烈分泌FLT3L，這是在沒(méi)有外源FLT3L的情況下再培養(yǎng)7天的細(xì)胞條件下的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）所顯示。

圖2 攜帶細(xì)胞因子的DCPs激活免疫并抑制黑色素瘤生長(zhǎng)

        然后，作者使用圖1a所示的方案，從CD45.1小鼠的BM中制備了對(duì)照DCPs （表達(dá)GFP的DCPs）和表達(dá)FLT3L和GFP的DCPs （以下簡(jiǎn)稱(chēng)DCP-FLT3L）。在本實(shí)驗(yàn)和隨后的DCPS轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，DCPS富集2小時(shí)后進(jìn)行LV轉(zhuǎn)導(dǎo)。作者在攜帶皮下B16F10黑色素瘤的CD45.2小鼠中接種富集的DCPs或DCP-FLT3L。與對(duì)照DCPs相比，DCP-FLT3L有效地?cái)U(kuò)大了腫瘤和脾臟中的內(nèi)源性cDC。此外，DCP-FLT3L增加了CD8+和CD4+ T效應(yīng)細(xì)胞（CD44+CD62L?）。因此，FLT3l武裝的DCPs可能通過(guò)擴(kuò)增內(nèi)源性cDCs和T效應(yīng)細(xì)胞啟動(dòng)小鼠抗腫瘤免疫。

        IL-12是T細(xì)胞活化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。鑒于IL-12提高了DCPs衍生的cDC1的T細(xì)胞共刺激能力，作者推斷DCPs轉(zhuǎn)基因表達(dá)IL-12將增強(qiáng)DPC-FLT3L引發(fā)的抗腫瘤免疫。作者在第2天轉(zhuǎn)導(dǎo)腦源性HSPCs生成DCP-IL-12（表達(dá)IL-12和GFP的DCPs）和對(duì)照DCPs（僅表達(dá)GFP的DCPs）。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第6天穩(wěn)定表達(dá)GFP， ELISA檢測(cè)顯示分泌IL-12。為了研究移植，作者轉(zhuǎn)導(dǎo)了富集的CD45.1 DCPs，并在無(wú)腫瘤的CD45.2小鼠中接種了2×106個(gè)細(xì)胞。DCP-IL-12沒(méi)有被反選擇，保留了轉(zhuǎn)基因表達(dá)，并在受體小鼠的脾臟中以預(yù)期的頻率產(chǎn)生成熟的cDCs。

        接下來(lái)，作者通過(guò)將DCPs與IL-12或FLT3L轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合，在荷瘤小鼠中進(jìn)行了DCPs轉(zhuǎn)移研究。在這些實(shí)驗(yàn)中，IL-12與中性標(biāo)記物dLNGFR（一種截?cái)嗟牡陀H和力人神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體）21偶聯(lián)，而FLT3L與GFP偶聯(lián)。作者在腫瘤攻擊后的第3天和第5天給B16F10腫瘤小鼠注射了1×106 DCP-IL-12和2×106 DCP-FLT3L的混合物（圖2a）。為了檢驗(yàn)表達(dá)IL-12或FLT3L的DCPs的效果，作者將它們分別與表達(dá)GFP或dLNGFR的DCPs結(jié)合。對(duì)照小鼠接受磷酸緩沖鹽水（PBS）或表達(dá)GFP或dLNGFR的DCPs。在獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，與單獨(dú)表達(dá)任一細(xì)胞因子的DCPs相比，DCP-IL-12和DCP-FLT3L（以下簡(jiǎn)稱(chēng)DCP-IL-12/FLT3L）的組合取得了更好的腫瘤控制效果（圖2b），包括隨訪時(shí)間較長(zhǎng)的研。在最后一次DCPS輸注后的第1天至第8天，血清IL-12和FLT3L水平均急劇下降（圖2c），這表明受體小鼠體內(nèi)無(wú)法穩(wěn)定植入產(chǎn)生細(xì)胞因子的DCPS。

3. 細(xì)胞因子武裝的DCPs激活抗腫瘤免疫

        B16F10腫瘤（包括作者研究中使用的表達(dá)OVA的變體）含有很少的T細(xì)胞浸潤(rùn)，并且對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷反應(yīng)較差。腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析揭示了DCPs衍生的IL-12和FLT3L之間的協(xié)同作用。與單獨(dú)表達(dá)任一細(xì)胞因子的DCPs相比，DCP-IL-12/FLT3L顯著增加了造血細(xì)胞、CD8+和CD4+ T細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)（圖2d）。此外，體外再刺激實(shí)驗(yàn)顯示，DCP-IL-12/ FLT3L處理小鼠的一些腫瘤中活化的IFNγ+ T細(xì)胞比例更高（圖2e）。腫瘤切片免疫熒光染色和定量分析證實(shí)了這些結(jié)果（圖2f）。DCP-IL-12/FLT3L和DCP-IL-12均能增強(qiáng)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM） MHCII的表達(dá)（>90%；圖2g和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5d），表明獲得免疫刺激表型。最后，在DCP-IL-12/ FLT3L處理的小鼠中，腫瘤引流淋巴結(jié)（tdLNs）中CD44+CD62L?T效應(yīng)細(xì)胞的相對(duì)豐度更高，表明激活了全身T細(xì)胞反應(yīng)。這些結(jié)果表明，IL-12/ FLT3L武裝DCPs在T細(xì)胞貧乏的黑色素瘤模型中促進(jìn)廣泛的免疫反應(yīng)。

4. 細(xì)胞因子武裝的DCPs通過(guò)IFNγ重編程腫瘤微環(huán)境

        然后，作者對(duì)整個(gè)B16F10腫瘤進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）分析，作者在第二次DCPs給藥后6天進(jìn)行了分析。由于黑素小體在黑色素瘤制備中大量存，作者只能準(zhǔn)確地識(shí)別主要的細(xì)胞簇（圖2h）。盡管如此，作者觀察到與載體治療的腫瘤相比，DCP-IL-12/ FLT3L治療的腫瘤的癌癥和髓細(xì)胞中IFNγ和i型IFN信號(hào)通路以及其他免疫反應(yīng)途徑（例如抗原遞呈）的激活，如根據(jù)Reactome和Hallmark對(duì)最不受管制的生物過(guò)程的無(wú)監(jiān)督排名所示（圖2i，j）。正如預(yù)期的那樣，IFNγ僅在淋巴細(xì)胞簇中可檢測(cè)到表達(dá)。結(jié)合上述基于流量的數(shù)據(jù)，scRNA-seq分析強(qiáng)烈表明，DCP-IL-12/FLT3L激發(fā)了IFNγ反應(yīng)，至少部分地通過(guò)對(duì)黑色素瘤和骨髓細(xì)胞的影響，有助于限制腫瘤生長(zhǎng)。此外，在DCP-IL-12/FLT3L治療的黑色素瘤中存在抗血管生成反應(yīng)（圖2k），這可能涉及IFN-γ27的直接血管修剪作用和間接機(jī)制；例如，通過(guò)m1編程（血管靜壓）TAMs28。

5. DCPs提供了一個(gè)替代moDCs的細(xì)胞治療平臺(tái)

        大多數(shù)載抗原DC的臨床前和臨床實(shí)驗(yàn)使用的是moDCs。然后，作者研究了IL-12和FLT3L的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是否會(huì)賦予moDCs在缺乏體外抗原負(fù)載的情況下擴(kuò)增T細(xì)胞和控制腫瘤生長(zhǎng)的能力。作者將1 × 106 DCP-IL-12或moDC-IL-12和2×106 DCP-FLT3L或moDC-FLT3L的混合物給予B16F10腫瘤小鼠，在腫瘤攻擊后的第3天和第5天（圖3a）。DCP-IL-12/FLT3L實(shí)現(xiàn)腫瘤穩(wěn)定，而moDC-IL-12/FLT3L僅延緩腫瘤生長(zhǎng)（圖3b）。在接受DCP-IL-12/FLT3L的小鼠中，這一結(jié)果與腫瘤中CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化顯著增加（圖3c）以及TDLN中cDCs和T效應(yīng)細(xì)胞（CD44+CD62L?）的擴(kuò)增相關(guān)。此外，經(jīng)體外再刺激，DCP-IL-12/ FLT3L處理的小鼠腫瘤中表達(dá)IFNγ、顆粒酶B （GZMB）和腫瘤壞死因子（TNF）的CD8+ T細(xì)胞比例更高（圖3d）。雖然DCP-IL-12/FLT3L和moDC-IL-12/FLT3L均可適度增加腫瘤中CD4+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化，但只有DCP-IL-12/FLT3L可增強(qiáng)tam中MHCII的表達(dá)?？傮w而言，DCP-IL-12/ flt3l處理小鼠的腫瘤細(xì)胞組成以T細(xì)胞為主，幾乎占活細(xì)胞的三分之二（圖3e）。這一結(jié)果可以解釋DCP-IL-12/FLT3L治療后觀察到的普遍IFNγ特征和標(biāo)記的M1編程。

        上述研究使用了以1:2比例表達(dá)IL-12或FLT3L的混合dc。為了探索作者平臺(tái)的多功能性，作者從一個(gè)雙胞LV中共表達(dá)了這兩種細(xì)胞因子，即在同一個(gè)細(xì)胞中，這代表了一種更適合臨床翻譯的策略。DCP-IL-12/FLT3L和moDC-IL-12/FLT3L在體外共表達(dá)IL-12和FLT3L，并在B16F10模型中表現(xiàn)出抗腫瘤活性（圖3f、g）。在涉及LV分裂轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究中觀察到，盡管moDC-IL-12/FLT3L劑量加倍可改善腫瘤控制，但DCPs比moDCs更有效?？偟膩?lái)說(shuō)，這些臨床前結(jié)果表明，細(xì)胞因子武裝的DCPs為抗原不可知的DC治療應(yīng)用提供了一種替代moDCs的策略。

        然后，作者在MC38模型中檢測(cè)DCP-IL-12/FLT3L，其特征是免疫抑制TAMS大量浸潤(rùn)。MC38荷瘤小鼠的處理方法與上面圖3a所示的黑色素瘤研究相同。DCP-IL-12/FLT3L實(shí)現(xiàn)了實(shí)質(zhì)性的MC38腫瘤控制（圖3h），促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3i），誘導(dǎo)TAM獲得M1樣表型（圖3j，k）。此外，DCP-IL-12/FLT3L強(qiáng)烈擴(kuò)增tdLNs中的cDCs和CD44+CD62L?T效應(yīng)細(xì)胞（圖31），這與B16F10黑色素瘤模型中的發(fā)現(xiàn)一致。

圖3 DCPs為moDCs提供了一種有效的細(xì)胞因子遞送平臺(tái)

6. 腫瘤對(duì)細(xì)胞因子武裝DCPs的反應(yīng)依賴(lài)于cDC1

圖4 腫瘤對(duì)細(xì)胞因子DCPs的反應(yīng)是 cDC1 和 IFNγ 依賴(lài)性的，但不需要 CD8+ T 細(xì)胞

        為了探索腫瘤對(duì)DCP-IL-12/FLT3L反應(yīng)的潛在機(jī)制，作者研究了DCPs轉(zhuǎn)移后早期時(shí)間點(diǎn)的B16F10腫瘤（第二次DCPs劑量后6天；圖4）。在腫瘤發(fā)展的早期階段，很少有造血細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，DCP-IL-12或DCP-IL-12/FLT3L僅適度增加了造血細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)。然而，后一種治療顯著增加了腫瘤中活化的自然殺傷（NK）細(xì)胞的豐度（圖4b）。因此，DCP-IL-12/FLT3L的早期腫瘤反應(yīng)可能主要涉及IL-12對(duì)NK細(xì)胞的依賴(lài)作用。有趣的是，DCP-IL-12和DCP-IL-12/FLT3L表現(xiàn)出雙重作用，減少腫瘤中的cDCs，同時(shí)增加tdLNs中的cDCs，包括CD11clow/+MHCII+/高遷移cDCs（圖4c、d）。這種反應(yīng)伴隨著tdLNs中CD44+CD62L?T效應(yīng)細(xì)胞的適度增加。相反，與tdln相比，DCP-FLT3L誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)cdc的增加更為明顯。這些結(jié)果支持了DCPs衍生的FLT3L直接促進(jìn)內(nèi)源性cDCs在腫瘤中的初始擴(kuò)張的假設(shè)，而IL-12通過(guò)NK細(xì)胞衍生的IFNγ誘導(dǎo)它們從腫瘤微環(huán)境（TME）遷移到tdLN。這種遷移將使cDC能夠啟動(dòng)tdLN中的T細(xì)胞啟動(dòng)。

        然后，作者探索內(nèi)源性cDC1和T細(xì)胞是否需要對(duì)DCP-IL-12/FLT3L的腫瘤抑制反應(yīng)。在Batf3?/?受體小鼠中缺乏內(nèi)源性cDC1完全否定了DCP-IL-12/FLT3L的治療活性（圖4e），并且無(wú)法在B16F10腫瘤中引起強(qiáng)大的T細(xì)胞浸潤(rùn)和激活（圖4f，g），這表明細(xì)胞因子修飾的DCPs通過(guò)內(nèi)源性cDC1激活抗腫瘤免疫。令人驚訝的是，DCP-IL-12/FLT3L在缺乏成熟T細(xì)胞和B細(xì)胞的Rag1?/?小鼠中也有效（圖4h）。在Rag1?/?小鼠的B16F10腫瘤中，作者觀察到活化的PD-1+ NK細(xì)胞的比例大大增加，這可能至少部分解釋了抗腫瘤作用的持久性。B16F10腫瘤接種于Batf3?/?、Rag1?/?和野生型小鼠的免疫細(xì)胞組成。這些結(jié)果使作者推測(cè)，DCP-IL-12/FLT3L的抗腫瘤活性依賴(lài)于內(nèi)源性cDC1，而不需要T效應(yīng)細(xì)胞的殺腫瘤功能。

7. 腫瘤反應(yīng)依賴(lài)于IFN γ，不依賴(lài)于CD8+ T細(xì)胞

        為了進(jìn)一步了解T細(xì)胞參與腫瘤對(duì)DCP-IL-12/FLT3L的反應(yīng)，作者在B16F10腫瘤小鼠中進(jìn)行了細(xì)胞耗盡和細(xì)胞因子中和研究（圖4i）。與Rag1?/?小鼠的研究結(jié)果一致，消除CD8+ T細(xì)胞并不影響腫瘤對(duì)DCP-IL-12/FLT3L的反應(yīng)，值得注意的是，同時(shí)消除CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞和NK1.1+ NK細(xì)胞只能適度地挽救腫瘤生長(zhǎng)（圖4j）。相比之下，中和IFNγ完全恢復(fù)腫瘤生長(zhǎng)，而使用集落刺激因子1受體（CSF1R）抗體消耗TAM部分恢復(fù)腫瘤生長(zhǎng)。值得注意的是，CSF1R不影響腫瘤和tdLN中的cDC數(shù)量，這與CSF1R?/?小鼠的研究結(jié)果一致。鑒于流式細(xì)胞術(shù)分析捕獲了相對(duì)細(xì)胞比例，作者使用非競(jìng)爭(zhēng)抗體對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫熒光染色以獲得定量數(shù)據(jù)（圖4k， 1）。DCP-IL-12/FLT3L增加F4/80+ TAM，這一反應(yīng)被CSF1R阻斷和IFNγ中和所消除，但不被T細(xì)胞和NK細(xì)胞消除所消除。此外，DCP-IL-12/FLT3L增加了CD8+和總CD3+ T細(xì)胞，但消除CD8+ T細(xì)胞并沒(méi)有減少總CD3+ T細(xì)胞數(shù)量，提示CD3+CD8?T細(xì)胞代償性浸潤(rùn)腫瘤。有趣的是，CD8+T細(xì)胞消除增加了NK細(xì)胞和tam，即使在CD8+和CD4+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞聯(lián)合消除后，它們?nèi)匀簧?。在一?xiàng)獨(dú)立研究中，單獨(dú)消除CD4+ T細(xì)胞或NK1.1+ NK細(xì)胞不會(huì)損害腫瘤對(duì)DCP-IL-12/FLT3L治療的反應(yīng)，并且破壞CD4+ T細(xì)胞與總CD8+ T細(xì)胞和活化（IFNγ+或GZMB+） CD8+ T細(xì)胞的代償性增加有關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明B16F10腫瘤對(duì)DCP-IL-12/FLT3L的反應(yīng)嚴(yán)格依賴(lài)于IFN Γ，涉及多種IFN Γ產(chǎn)生細(xì)胞，并且可能至少部分依賴(lài)于IFN Γ刺激的M1樣TAM的抗腫瘤活性。

圖5 細(xì)胞因子武裝DCPs在結(jié)直腸癌模型中提高了順鉑和PD-1阻斷的療效

        最后，為了探索IFNγ對(duì)B16F10黑色素瘤細(xì)胞的潛在直接影響，作者產(chǎn)生了ifngr1敲除的B16F10細(xì)胞。盡管觀察到腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)和活化增強(qiáng)（圖4n，o），但消除癌細(xì)胞對(duì)IFNγ的反應(yīng)性足以否定DCP-IL-12/FLT3L在小鼠中的治療活性（圖4m）。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明IFNγ是腫瘤抑制的關(guān)鍵介質(zhì)，并強(qiáng)烈表明IFNγ的產(chǎn)生，而不是直接的CD8+ T細(xì)胞毒性，是DCP-IL-12/FLT3L治療反應(yīng)所必需的。

8. 細(xì)胞因子武裝的DCPs提高了化學(xué)免疫治療的療效

        B16F10和MC38腫瘤表現(xiàn)出快速的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，這使得晚期腫瘤治療干預(yù)的評(píng)估復(fù)雜化。為了減緩MC38腫瘤的生長(zhǎng)，作者用單劑量順鉑（一種用于結(jié)直腸癌治療的化療藥物）對(duì)MC38荷瘤小鼠進(jìn)行預(yù)處理。隨后在第11天和第13天注射DCP-IL-12/FLT3L，從第14天開(kāi)始注射PD-1阻斷抗體，每周兩次（圖5a）。雖然順鉑和抗PD-1聯(lián)合使用延遲了腫瘤生長(zhǎng)，但在順鉑中加入DCP-IL-12/FLT3L可改善抗腫瘤反應(yīng)，PD-1阻斷可進(jìn)一步改善這種反應(yīng)（圖5b）。聯(lián)合治療（順鉑，DCPs，抗PD-1）導(dǎo)致8只小鼠中的3只腫瘤消退或穩(wěn)定（第27天和第11天），而其他組中所有腫瘤進(jìn)展（圖5c）。DCP-IL-12/FLT3L聯(lián)合順鉑增加了造血細(xì)胞、CD8+和CD4+ T細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的浸潤(rùn)，不依賴(lài)于PD-1阻斷（圖5d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8b）。值得注意的是，大多數(shù)T細(xì)胞表現(xiàn)出非耗盡的激活表型。此外，體外再刺激實(shí)驗(yàn)顯示，在接受完整治療方案的小鼠腫瘤中，CD8+ T細(xì)胞中IFNγ、GZMB和TNF的表達(dá)增強(qiáng)，CD4+ T細(xì)胞中IFNγ的表達(dá)升高（圖5e），這可能解釋了PD-1阻斷的附加益處。相反，用順鉑和抗PD-1治療的小鼠腫瘤內(nèi)CD8+或CD4+ T細(xì)胞未升高，主要表現(xiàn)為衰竭表型。這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞因子武裝的DCPs提高了結(jié)直腸癌模型的化學(xué)免疫治療效果。

9. 細(xì)胞因子武裝DCPs增加腫瘤模型中T細(xì)胞受體的多樣性

        作者通過(guò)T細(xì)胞受體β （TCRβ）的批量測(cè)序來(lái)檢測(cè)MC38腫瘤中的T細(xì)胞多樣性。作者觀察到接受DCP-IL-12/FLT3L的腫瘤的T細(xì)胞庫(kù)具有更高多樣性的趨勢(shì)，如更多的獨(dú)特克隆型所示（圖5f）。有趣的是，如無(wú)監(jiān)督k均值聚類(lèi)所示，接受DCP-IL-12/FLT3L治療的小鼠腫瘤中的T細(xì)胞在其TCR中的V基因使用方面具有顯著的相似性（圖5g）。這些發(fā)現(xiàn)表明，DCP-IL-12/FLT3L促進(jìn)T細(xì)胞的擴(kuò)增，并對(duì)MC38腫瘤相關(guān)抗原具有共同的特異性。

圖6 細(xì)胞因子武裝的DCP在兩種基因工程肝癌模型中均有效

        作者探索DCPs是否在兩種通過(guò)流體動(dòng)力尾靜脈注射（HDTVi）致癌質(zhì)粒獲得的基因工程肝癌模型中也有效。在第一個(gè)模型中，在肝細(xì)胞中激活KrasG12D癌基因并缺失Trp53可誘導(dǎo)具有肝細(xì)胞癌和膽管癌特征的多灶性肝臟腫瘤。KrasG12D； Trp53?/?腫瘤建立了免疫抑制和幾乎免疫荒漠的TME，并表現(xiàn)出侵襲性生長(zhǎng)模式，小鼠中位生存期約為30天。單用抗PD-1、順鉑聯(lián)合抗PD-1或DCP-IL-12/FLT3L聯(lián)合順鉑和抗PD-1治療腫瘤啟動(dòng)小鼠（圖6a）。與其他治療相比，DCP-IL-12/FLT3L顯著延長(zhǎng)了生存期（圖6b）。值得注意的是，盡管從腫瘤誘導(dǎo)到終止的平均時(shí)間較長(zhǎng)，但這些小鼠的大腫瘤較少（圖6c）。

        在兩項(xiàng)獨(dú)立研究中，作者分析了固定時(shí)間點(diǎn)（腫瘤發(fā)生后第23天）的肝臟。此時(shí)，三聯(lián)組小鼠的宏觀肝臟腫瘤數(shù)量大幅減少，11只小鼠中有4只無(wú)腫瘤（圖6d-f），與生存研究結(jié)果一致。肝實(shí)質(zhì)免疫熒光染色顯示，與其他治療相比，大多數(shù)接受DCP-IL-12/FLT3L治療的小鼠的CD8+和CD4+ T細(xì)胞密度增加。作者還在分析的同一時(shí)間點(diǎn)（第23天）用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞參數(shù)。DCP-IL-12/FLT3L增加了肝實(shí)質(zhì)中的CD8+和CD4+ T細(xì)胞，無(wú)論是CD45+造血細(xì)胞的比例（圖6g）還是絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖6h）。此外，DCP-IL-12/FLT3L增加了CD44+CD62L?CD8+和CD4+ T效應(yīng)細(xì)胞（圖6i）和IFNγ+ CD8+ T細(xì)胞（圖6j，k）。在肝引流淋巴結(jié)和脾臟中也觀察到更高比例的CD44+CD62L?CD8+ T效應(yīng)細(xì)胞（圖6l）。

        然后，作者采用了基于HDTV的Myc驅(qū)動(dòng)和Trp53缺失肝癌模型，該模型比KrasG12D； Trp53?/?模型發(fā)生的腫瘤更少。Myc； Trp53?/?腫瘤具有肝細(xì)胞癌的特征，具有功能失調(diào)的DC，并且對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷具有抗性。單用抗PD-1、順鉑聯(lián)合抗PD-1或DCP-IL-12/FLT3L聯(lián)合順鉑和抗PD-1治療腫瘤啟動(dòng)小鼠（圖6）。在該模型中，DCP-IL-12/FLT3L達(dá)到了100%的生存率，優(yōu)于其他治療組的生存率（圖6n）。此外，在固定時(shí)間點(diǎn)（腫瘤發(fā)生后第21天）分析的獨(dú)立小鼠隊(duì)列顯示，DCP-IL-12/FLT3L組的6只小鼠中有5只沒(méi)有宏觀腫瘤的證據(jù)，而其他組中至少有50%的小鼠有腫瘤。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在接受DCP-IL-12/FLT3L治療的小鼠中，CD4+（而非CD8+） T細(xì)胞比例增加；這種反應(yīng)與肝引流淋巴結(jié)和脾臟中CD4+和CD8+ T效應(yīng)細(xì)胞比例升高有?？傊趦煞N侵襲性肝癌模型中，細(xì)胞因子武裝DCPs通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN γ的T細(xì)胞、降低腫瘤多樣性和延長(zhǎng)生存期來(lái)改善腫瘤對(duì)順鉑和抗PD-1的反應(yīng)。

10. 細(xì)胞因子武裝的DCPs在膠質(zhì)瘤模型中與CAR-T協(xié)同作用

        CAR-T是具有工程腫瘤特異性的T細(xì)胞。雖然CAR-T可以識(shí)別并殺死表達(dá)靶向抗原的癌細(xì)胞，但其在實(shí)體腫瘤中的治療效果受到抗原異質(zhì)性和免疫抑制TME的限制。作者使用了侵襲性SB28小鼠膠質(zhì)瘤模型，它概括了人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵特征，免疫沉默，對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷無(wú)反應(yīng)。作者使用了針對(duì)GD2的CAR-T， GD2是一種在人類(lèi)膠質(zhì)瘤亞群中表達(dá)的雙胞脂苷，也是一種經(jīng)臨床驗(yàn)證的CAR-T靶標(biāo)。GD2+ SB28膠質(zhì)瘤細(xì)胞是通過(guò)用編碼GD2合成酶、GD2S和GD3S的lv轉(zhuǎn)導(dǎo)親本細(xì)胞系產(chǎn)生的。抗GD2 CAR-T在體外有效殺傷GD2+細(xì)胞，但不殺傷GD2 - SB28細(xì)胞。

圖7 細(xì)胞因子武裝的DCP在兩種基因工程肝癌模型中均有效

        作者在小鼠腦內(nèi)接種SB28-GD2細(xì)胞，并用DCP-IL-12/FLT3L、抗GD2 CAR-T或兩者的組合處理它們（圖7a）。通過(guò)縱向?qū)崟r(shí)成像分析監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展。接受DCP-IL-12/FLT3L和CAR-T聯(lián)合治療的小鼠存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于單獨(dú)接受任何一種細(xì)胞治療的小鼠（圖7b）。雖然DCP-IL-12/FLT3L或CAR-T單藥治療中度延遲腫瘤進(jìn)展，但CAR-T隊(duì)列中除一只小鼠外，所有小鼠均出現(xiàn)進(jìn)展性疾?。▓D7c，d）。相反，聯(lián)合治療在5只小鼠中有4只小鼠腫瘤消退，直到研究結(jié)束（腫瘤接種后第71天）仍無(wú)腫瘤。

        上述研究使用了表達(dá)IL-12或FLT3L的DCPs混合物。然后，作者使用雙頻IL-12/FLT3L LV單導(dǎo)的DCPs重復(fù)了膠質(zhì)瘤研究。與上述結(jié)果一致，DCP-IL-12/FLT3L + CAR-T在8只小鼠中根除了6只小鼠的腫瘤（1只小鼠在無(wú)腫瘤時(shí)被殺死），而其他組的所有小鼠都出現(xiàn)了進(jìn)行性疾病（圖7e-g）。死后大腦免疫熒光染色顯示，通過(guò)活體成像評(píng)估為無(wú)腫瘤的小鼠中未檢測(cè)到膠質(zhì)瘤細(xì)胞；有趣的是，大量的CD3+ T細(xì)胞浸潤(rùn)持續(xù)存在于腫瘤完全消退的部位。因此，DCP-IL-12/FLT3L與GD2特異性CAR-T協(xié)同作用可根除小鼠大部分顱內(nèi)膠質(zhì)瘤。

        小鼠DCPs的臨床前療效促使作者測(cè)試人類(lèi)臍帶血CD34+ HSPCs是否支持DCPS分化。在1周內(nèi)，在FLT3L、IL-3、IL-6、TPO和小分子UM729存在下培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞顯著擴(kuò)增（圖8 e），并獲得更分化的祖細(xì)胞狀態(tài)，包括常見(jiàn)的髓系祖細(xì)胞、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞和DC祖細(xì)胞、單核細(xì)胞-DC祖細(xì)胞（MDPs）、CDPs和前DCs。雖然表達(dá)CDP標(biāo)記物的細(xì)胞頻率可以忽略不計(jì)（<0.1%），但培養(yǎng)的細(xì)胞含有相當(dāng)大比例（約7%）的MDPs。鑒于MDPs是單核抗原呈遞細(xì)胞（APCs）的前體，包括CDPs、cDC1和cDC2，作者研究了含有MDPs的細(xì)胞群（鑒定為Lin-CD34+CD115+，暫時(shí)稱(chēng)為DCPs）產(chǎn)生cDCs的能力。在第7天，Lin-CD34 +CD115+ DCPs表達(dá)了CDPs和MDPs之間共享的標(biāo)記（例如，CD117/KIT， CD135和CD45RA；圖8 b）。這些細(xì)胞可以從臍帶血和動(dòng)員外周血（MPB）中獲得，MPB是CD34+ HSPCs41的臨床來(lái)源。然而，臍帶血比MPB產(chǎn)生更多的DCPs（圖8c，d）。臍帶血和MPB衍生的DCPs都可以被表達(dá)dLNGFR的LV有效轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖8e），這表明LV轉(zhuǎn)導(dǎo)在該細(xì)胞群中是可行的。

        為了研究Lin-CD34+CD115+ DCPs的APC分化能力，作者從7天臍帶血或MPB培養(yǎng)中分離出Lin-CD34+CD115+ DCPs，并在cDC培養(yǎng)基（含FLT3L、GM-CSF、SCF和IFNα）中培養(yǎng)。作為對(duì)照，作者模擬了第7天的細(xì)胞，其中大多數(shù)是CD115?。1周后（第14天），Lin-CD34+CD115+細(xì)胞有效地分化為APC，包括單核細(xì)胞、cDC1、cDC2和未成熟的DC，其他細(xì)胞類(lèi)型的貢獻(xiàn)較小，而是在模擬分類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)中擴(kuò)增（圖8f）。這些結(jié)果表明Lin-CD34+CD115+細(xì)胞可以作為人DCPs發(fā)揮作用。

圖8 人HSPC是具有抗原呈遞能力的DCP的來(lái)源

        接下來(lái)，作者評(píng)估了人類(lèi)DCPS衍生細(xì)胞（稱(chēng)為DCPs后代）和moDC的抗原呈遞能力。作者使用巨細(xì)胞病毒（CMV）蛋白PP65和HLA - A2限制性CMV特異性T細(xì)胞。作者研究了三種抗原呈遞途徑:（1）呈遞PP65495-504肽負(fù)載的HLA-A2，模擬直接呈遞；（2）交叉呈遞由天然PP65蛋白內(nèi)源性加工而成的PP65495-504肽；（3）細(xì)胞外囊泡攜帶PP65495-504 HLA-A2對(duì)DC進(jìn)行抗原交叉修飾。T細(xì)胞與先前暴露于PP65495-504肽、PP65蛋白或裝載PP65495-504的細(xì)胞外囊泡的DCPS子代或moDCs共培養(yǎng)，分別測(cè)定直接呈遞、交叉呈遞和交叉呈遞。對(duì)于變裝，作者使用從HLA-A2+或陰性的人類(lèi)黑色素瘤細(xì)胞中分離的細(xì)胞外囊泡和從HLA-A2陰性供者獲得的DC，前提是HLA-A2陰性的細(xì)胞外囊泡不會(huì)通過(guò)變裝激活HLA-A2限制性T細(xì)胞。在每種情況下，DCPS后代比moDCs更有效地激活cmv特異性T細(xì)胞，盡管T細(xì)胞的激活程度因供體而異（圖8g – 1）這些結(jié)果表明，人類(lèi)DCPs，鑒定為Lin-CD34 +CD115+細(xì)胞，可以分化為具有抗原呈遞能力的細(xì)胞后代。

結(jié)論

        這一發(fā)現(xiàn)表明，DCPs部署IL-12可能直接增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞?；蛘?，DCPs可能協(xié)調(diào)IFN γ依賴(lài)的內(nèi)源性免疫反應(yīng)，消除逃避CAR-T細(xì)胞識(shí)別和殺死的癌細(xì)胞。這些結(jié)果，再加上開(kāi)發(fā)人類(lèi)DCPs樣細(xì)胞的可行性，激發(fā)了基于抗原不可知的DCPs治療的進(jìn)一步臨床前研究。

實(shí)驗(yàn)方法：

        逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)，小鼠骨髓細(xì)胞的分離，小鼠DCPs的生成， DCPs的分化，小鼠moDCs和CDC1樣細(xì)胞的生成，OT-I和OT-II T細(xì)胞與載抗原cDC1樣細(xì)胞共培養(yǎng)，小鼠DCP和moDCs與LVs的轉(zhuǎn)導(dǎo)，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生，CAR-T細(xì)胞殺傷試驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)分析，免疫熒光染色，人T細(xì)胞刺激試驗(yàn)，scRNA-seq，整體TCR測(cè)序。

參考文獻(xiàn)：

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