黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移信號通路：HDAC8介導(dǎo)EP300 抑制驅(qū)動轉(zhuǎn)錄狀態(tài)

        皮膚黑色素瘤是最致命的皮膚癌類型，有向多個器官轉(zhuǎn)移的傾向。黑色素瘤轉(zhuǎn)移發(fā)展的一個常見部位是大腦，如果不治療，黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移（Melanoma Brain Metastases，MBMs）迅速進(jìn)展，大多數(shù)患者在3個月內(nèi)死亡。對MBM發(fā)展的分子驅(qū)動因素知之甚少。迄今為止，大多數(shù)研究都集中在PTEN丟失和AKT信號過度激活上，這限制了對于黑色素瘤異質(zhì)性的調(diào)節(jié)。本研究確定應(yīng)激誘導(dǎo)的HDAC8活性驅(qū)動了黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移發(fā)展，通過ATAC-Seq和ChIP-Seq表明HDAC8活性增加是通過H3K27ac和c-Jun結(jié)合位點(diǎn)可及性的增強(qiáng)改變了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。HDAC8被鑒定為轉(zhuǎn)錄輔因子失活和染色質(zhì)可及性的介質(zhì)，驅(qū)動腦轉(zhuǎn)移。

        該研究于2023年11月29日發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 黑色素瘤細(xì)胞受到壓力后HDAC8活性增加

        作者首先確定了HDAC8是否是黑色素瘤細(xì)胞狀態(tài)變化的表觀遺傳驅(qū)動因素。黑色素瘤細(xì)胞的WB分析表明，黑色素瘤細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)錄因子MITF的高表達(dá)與較低的HDAC8表達(dá)相關(guān)，并降低由HDAC8調(diào)節(jié)的信號分子水平，包括SMC3乙?；?span>EGFR磷酸化和c-Jun磷酸化（圖1a）。根據(jù)細(xì)胞對BRAF抑制劑（BRAFi）vemurafenib的基線敏感性對其進(jìn)行排名，并證明高MITF表達(dá)、低HDAC8表達(dá)和高BRAFi敏感性之間的聯(lián)系（圖1a）。同樣， HDAC8低表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞中過表達(dá)HDAC8后磷酸化Jun和EGFR水平增加（圖1b）。由于轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)換可能是對外源性應(yīng)激的反應(yīng)，作者接下來探討了HDAC8的過表達(dá)是否會增加不同微環(huán)境條件下黑色素細(xì)胞的存活。HDAC8表達(dá)的增加導(dǎo)致暴露于缺氧、紫外線照射和BRAF-MEKi治療后的黑色素瘤細(xì)胞存活增加（圖1c-e）。為了確定這是否與黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞間的保守反應(yīng)有關(guān)，用紫外線照射處理了2個原代人類黑色素細(xì)胞系（FOM173和NHEM），并發(fā)現(xiàn)HDAC8和磷酸化c-Jun表達(dá)增加（圖1f）。人類黑色素細(xì)胞系（HERMES1和HERMES3）中HDAC8表達(dá)升高導(dǎo)致MITF表達(dá)下降，磷酸化c-Jun水平增加（圖1g），并在細(xì)胞受到缺氧或紫外線照射時提高了存活率（圖1h&i）。

圖1：HDAC8表達(dá)賦予黑色素細(xì)胞和黑色素瘤抗逆性

2. HDAC8驅(qū)動黑色素瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄開關(guān)

        對兩個黑色素瘤細(xì)胞系（WM164和SK-MEL-28）進(jìn)行RNA-seq分析，以確定HDAC8的上調(diào)如何重塑轉(zhuǎn)錄格局，發(fā)現(xiàn)隨著HDAC8的表達(dá)升高，204個常見基因顯著增加，163個常見基因顯著減少（圖2a）。KEGG分析顯示，HDAC8高表達(dá)導(dǎo)致了黑色素瘤轉(zhuǎn)移等途徑的富集，包括PI3K-AKT信號、局灶粘附、ECM-受體相互作用、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、MAPK信號和RAP1信號（圖2b），同時減少了一些代謝途徑如谷胱甘肽和嘌呤代謝的富集（圖2c）。這些數(shù)據(jù)表明HDAC8驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄程序與侵襲性、轉(zhuǎn)移性表型相關(guān)，接下來確定HDAC8表達(dá)增加是否與黑色素瘤轉(zhuǎn)錄狀態(tài)相關(guān)。最近對黑色素瘤異質(zhì)性的分析確定了幾種不同的細(xì)胞狀態(tài)，包括未分化胚胎干細(xì)胞（ESC）狀態(tài)、神經(jīng)嵴干細(xì)胞（NCSC）樣狀態(tài)和分化黑色素細(xì)胞狀態(tài)等。對數(shù)據(jù)集的分析表明，HDAC8高表達(dá)富集了 WM164細(xì)胞中的NCSC和未分化狀態(tài)相關(guān)的基因（圖2d&e）。通過分析WM164和1205Lu細(xì)胞中NCSC基因啟動子區(qū)域的H3K27ac 的ChIP-Seq數(shù)據(jù)，驗(yàn)證了NCSC基因轉(zhuǎn)錄活性的增加。與NCSC狀態(tài)相關(guān)的基因，包括AXL、FAM83G、FOSL1和SOX2，增加了HDAC8過表達(dá)細(xì)胞中的H3K27ac乙?；▓D2f）；而與黑色素細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的基因，包括MLANA、DCT、TYR和PMEL，減少了HDAC8過表達(dá)細(xì)胞中的H3K27ac乙?；▓D2g）。

圖2： HDAC8驅(qū)動黑色素瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄開關(guān)

3. HDAC8驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)導(dǎo)致侵襲性變形蟲表型

        轉(zhuǎn)移到大腦的細(xì)胞必須克服多種障礙，包括通過血腦屏障外滲、在循環(huán)系統(tǒng)的高剪應(yīng)力條件和腦實(shí)質(zhì)富含蛋白酶的環(huán)境中生長。由于在RNA-seq和ChIP-Seq分析中上調(diào)的許多基因與侵襲增加有關(guān)，所以進(jìn)行了3D球形膠原蛋白侵襲和基質(zhì)膠侵襲檢測，發(fā)現(xiàn)WM164和SK-MEL-28細(xì)胞在HDAC8過表達(dá)后細(xì)胞侵襲增強(qiáng)（圖3a-d）。接下來觀察HDAC8是否通過使用模擬一般循環(huán)中經(jīng)歷的剪切水平的流動室系統(tǒng)來增加黑色素瘤細(xì)胞對剪切應(yīng)力的彈性。WM164和SK-MEL-28細(xì)胞暴露于高水平的流體剪切應(yīng)力24h后，對照細(xì)胞高水平死亡（圖3e&f）。HDAC8上調(diào)的許多基因參與細(xì)胞骨架重排，包括與變形蟲表型相關(guān)的SOX2和PROM1。WM164和SK-MEL-28細(xì)胞表達(dá)HDAC8后被鍍在膠原蛋白上時采用了圓形變形蟲表型（圖3g）。由于變形蟲表型可以允許細(xì)胞擠過狹窄的空間，例如離開血管和穿過血腦屏障相關(guān)的空間，進(jìn)行跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移檢測，發(fā)現(xiàn)HDAC8過表達(dá)導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞通過匯合內(nèi)皮細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移性增加了十倍（圖3h&i）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明HDAC8驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄程序可以增加體內(nèi)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲。

圖3： HDAC8增加黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和變形蟲樣狀態(tài)

4. HDAC8增加小鼠腦轉(zhuǎn)移的發(fā)展

        接下來，作者檢測HDAC8驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)是否改變了體內(nèi)轉(zhuǎn)移播種的模式。對照組或表達(dá)HDAC8的WM164被注射到小鼠心臟左心室和每隔5天收集的器官中，以確定潛在的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)。過表達(dá)HDAC8和EV組之間肝臟或肺轉(zhuǎn)移的總發(fā)生率差異不大（圖4a）。與第5天的EV細(xì)胞相比，HDAC8表達(dá)后肝轉(zhuǎn)移數(shù)量顯著增加，但在之后的時間點(diǎn)不再顯著（圖4b）。對肺的分析顯示，隨著時間的推移，HDAC8表達(dá)組和EV對照組之間的轉(zhuǎn)移發(fā)展動態(tài)相似（圖4c）。作者接下來關(guān)注高表達(dá)HDAC8的黑色素瘤細(xì)胞形成黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移的傾向。在心內(nèi)注射后， SK-MEL-28、WM164和1205Lu的高表達(dá)HDAC8黑色素瘤細(xì)胞與對照相比，出現(xiàn)更多的腦轉(zhuǎn)移（圖4d-f）。神經(jīng)病理學(xué)檢查確定腫瘤累及側(cè)腦室顳角的室管膜表面，已經(jīng)侵犯到腦實(shí)質(zhì)，腫瘤邊界侵犯血管周圍。為了解決發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性，作者對臨床黑色素瘤樣本進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq分析。這些分析顯示，人類黑色素瘤細(xì)胞中HDAC8表達(dá)與NCSC樣基因表達(dá)譜之間存在顯著相關(guān)性（圖4g&h）。根據(jù)轉(zhuǎn)移部位進(jìn)行的更詳細(xì)的細(xì)分顯示，LMD和腦轉(zhuǎn)移樣本中HDAC8表達(dá)與NCSC樣狀態(tài)之間存在顯著相關(guān)性，但與皮膚轉(zhuǎn)移樣本無關(guān)。然而，這可能是由于皮膚轉(zhuǎn)移樣本中腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少。黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移通常富含OXPHOS代謝基因。

圖4： HDAC8增加黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移的建立

5. HDAC8增加了Jun靶向基因的染色質(zhì)可及性和H3K27ac

        作者接下來使用ATAC-Seq和ChIP-Seq來確定HDAC8如何調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄重編程。ChIP-Seq數(shù)據(jù)的整體分析顯示HDAC8表達(dá)對H3K27ac在啟動子或增強(qiáng)子區(qū)域幾乎沒有整體影響（圖5a&b），總乙酰-H3組蛋白水平也幾乎沒有變化（圖5c）。H3K27ac ChIP-Seq數(shù)據(jù)的HOMER分析顯示，過表達(dá)HDAC8時，Jun位點(diǎn)的H3K27乙酰化增加，而對照細(xì)胞在對細(xì)胞周期進(jìn)展重要的轉(zhuǎn)錄因子（包括B-myb和A-myb）上表現(xiàn)出H3K27乙酰化增加（圖5d）?；蚍鍞?shù)/長度的ATAC-seq分析顯示，在HDAC8過表達(dá)和EV細(xì)胞中，DNA片段大小相似（圖5e）。雖然整個基因組的總體可及性相似，但在HDAC8表達(dá)細(xì)胞中，啟動子的可及性增加（圖5f），而在非啟動子位點(diǎn)幾乎沒有差異（圖5g）。對HDAC8表達(dá)時可及性增加的基序的分析包括多個AP-1轉(zhuǎn)錄因子（Fra1，ATF3，Jun）和TEADs（圖5h，補(bǔ)充圖10a，b）。多個基序在HDAC8引入時也顯示下調(diào)，包括CTCF、多個SOX轉(zhuǎn)錄因子和黑色素細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)錄因子MITF（圖5h）。

圖5：HDAC8激活誘導(dǎo)Jun和MITF靶向基因的染色質(zhì)可及性的變化

6. EP300失活導(dǎo)致Jun轉(zhuǎn)錄活性增加

        ATAC-Seq和ChIP-Seq數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)整合表明HDAC8表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)組裝、細(xì)胞分化相關(guān)的基因通路中的可及性/轉(zhuǎn)錄激活（圖6a）。盡管ATAC-Seq和ChIP-Seq數(shù)據(jù)顯示HDAC8介導(dǎo)的H3K27ac或染色質(zhì)可及性的總體變化很少，但在WM164和1205Lu細(xì)胞系中都注意到離散Jun和MITF位點(diǎn)的變化。許多與NCSC表型有關(guān)的基因，如SOX2，由c-Jun調(diào)節(jié)，并在HDAC8過表達(dá)細(xì)胞中表現(xiàn)出可及性/H3K27乙?；黾樱▓D6b），而MITF調(diào)節(jié)的基因，如MLANA的可及性降低（圖6c）。作者注意到HDAC8的表達(dá)導(dǎo)致多個Serpins（如Serpin E1，E2和A1）的基因表達(dá)，H3K27ac和染色質(zhì)可及性增加，這些蛋白酶抑制劑有助于腦轉(zhuǎn)移的建立。這些結(jié)果表明HDAC8的過表達(dá)導(dǎo)致從MITF驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄程序到c-Jun調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄程序的轉(zhuǎn)變。

        由于HDAC8對全局染色質(zhì)可及性的影響相對較小，接下來探究了HDAC8是否通過調(diào)節(jié)非組蛋白靶點(diǎn)發(fā)揮作用。進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析以確定HDAC8如何影響黑色素瘤細(xì)胞的“乙?；?span>”。 STRING分析發(fā)現(xiàn)參與脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的顯著去乙酰化蛋白質(zhì)（圖6d），確定的中心樞紐之一是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）EP300/CREBBP。已知EP300可以乙?；喾N蛋白質(zhì)，包括MITF和c-Jun。 EP300結(jié)構(gòu)分析確定了它的HAT結(jié)構(gòu)域中的4個賴氨酸殘基（賴氨酸的1542、1546、1549和1550），它們在HDAC8過表達(dá)時被脫乙?；▓D6e）。HDAC8對EP300的脫乙?；芰νㄟ^免疫沉淀和總蛋白乙酰化的免疫印跡（圖6f）得到證實(shí)。在兩個獨(dú)立的黑色素瘤細(xì)胞系中，EP300的脫乙?；c其HAT活性的降低（通過組蛋白H4的乙?；瘻y量）相關(guān)（圖6g）。NCSC和黑色素細(xì)胞表型相關(guān)基因的單位點(diǎn)ChIP檢測顯示，HDAC8表達(dá)的增加與EP300與AXL的Jun啟動子的結(jié)合增加以及EP300與MLANA的MITF啟動子的結(jié)合減少有關(guān)（圖6h）。這些結(jié)果表明HDAC8通過抑制其HAT活性將其從MITF啟動子位點(diǎn)轉(zhuǎn)換為Jun啟動子位點(diǎn)來調(diào)節(jié)EP300功能。

圖6： HDAC8去乙?；Щ?span>EP300，導(dǎo)致JUN轉(zhuǎn)錄活性增加

7. 抑制EP300驅(qū)動黑色素瘤腦轉(zhuǎn)移的發(fā)展

        由于EP300是HDAC8的直接靶點(diǎn)，作者接下來探索了EP300在驅(qū)動抗應(yīng)激、侵襲表型中的作用。首先確定了對BRAFi治療敏感或耐藥的黑色素瘤細(xì)胞系中EP300和CREBBP的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)對抑制劑治療敏感的細(xì)胞系EP300水平增加（圖7a）。對TCGA黑色素瘤數(shù)據(jù)庫的研究強(qiáng)調(diào)了與EP300/HDAC8水平不變的患者相比， EP300水平降低和HDAC8水平升高與總體生存率降低之間的相關(guān)性。然后進(jìn)行功能研究以確定抑制EP300（通過HDAC8模仿其去乙?；┦欠駮淖兒谏亓黾?xì)胞對BRAFi治療的敏感性。BRAF突變黑色素瘤細(xì)胞系與EP300/CREBBP抑制劑I-CBP112聯(lián)合治療降低了黑色素瘤細(xì)胞對BRAFi的敏感性，增加了形成的菌落數(shù)量（圖7b&c）。通過特異性siRNA沉默EP300也有類似的效果，并被發(fā)現(xiàn)BRAFI-MEKi治療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平降低（圖7d）。這種影響與c-Jun活性的增加有關(guān)，發(fā)現(xiàn)抑制EP300可以增加轉(zhuǎn)錄活性的磷酸化c-Jun水平（圖7e）。進(jìn)一步的研究表明，通過shRNA敲低沉默EP300也保護(hù)WM164和SK-MEL-28黑色素瘤細(xì)胞免受紫外線照射和缺氧損傷（圖7f&g）。由于表達(dá)HDAC8的細(xì)胞具有高度侵襲性，接下來研究調(diào)節(jié)EP300的表達(dá)是否會改變黑色素瘤細(xì)胞的侵襲能力。通過shRNA敲除沉默EP300增加了黑色素瘤細(xì)胞對3D膠原基質(zhì)的侵襲（圖7h-j）。因此，與shRNA對照組相比，心內(nèi)注射EP300沉默的SK-MEL-28細(xì)胞增加了腦轉(zhuǎn)移小鼠的數(shù)量（圖7k&l）。綜上表明HDAC8介導(dǎo)的EP300去乙酰化導(dǎo)致HAT活性降低，轉(zhuǎn)錄活性JUN增加，以及從黑色素細(xì)胞轉(zhuǎn)換為NCSC樣。

圖7： EP300的抑制作用驅(qū)動了黑色素瘤細(xì)胞中的抗壓侵襲性表型

結(jié)論

        本研究證明在黑色素瘤細(xì)胞中，HDAC8介導(dǎo)的去乙?；瘜?dǎo)致從MITF到Jun驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄程序的轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致采用NCSC狀態(tài)特征的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。Jun蛋白的去乙酰化增加了其磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致Jun/AP-1驅(qū)動類似NCSC的轉(zhuǎn)錄程序的啟動。與此同時，HDAC8介導(dǎo)的EP300去乙酰化抑制其HAT功能，降低MITF啟動子位點(diǎn)的可及性，并改變H3K27在關(guān)鍵黑色素細(xì)胞基因中的分布。HDAC8誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄程序?qū)е潞谏亓黾?xì)胞采用高度彈性的變形蟲表型，從而在剪切應(yīng)力條件下和腦實(shí)質(zhì)中驅(qū)動侵襲和存活。這種HDAC8驅(qū)動的程序也在暴露于紫外線照射的黑色素細(xì)胞中觀察到，提供了保守的黑色素細(xì)胞存活程序和黑色素瘤細(xì)胞侵襲性轉(zhuǎn)移行為之間的聯(lián)系。

實(shí)驗(yàn)方法

        細(xì)胞培養(yǎng)，質(zhì)粒的生成和轉(zhuǎn)染，免疫印跡，免疫沉淀，細(xì)胞活力測定，附著力/遷移分析，HAT活性測定，RNA測序和數(shù)據(jù)分析，ChIP測序和數(shù)據(jù)分析，ATAC測序和數(shù)據(jù)分析，scRNA-Seq數(shù)據(jù)分析，乙酰組學(xué)，小鼠體內(nèi)試驗(yàn)，HE染色，免疫組織化學(xué)分析

參考文獻(xiàn)

        Emmons Michael F, Bennett Richard L, Riva Alberto et al. HDAC8-mediated inhibition of EP300 drives a transcriptional state that increases melanoma brain metastasis. [J] .Nat Commun, 2023, 14: 7759.