三陰性乳腺癌中的鐵死亡異質(zhì)性揭示了一種創(chuàng)新的免疫治療聯(lián)合策略

         鐵死亡（Ferroptosis）最早由哥倫比亞大學(xué)Dr. Brent R.Stockwell在2012年提出，是一種鐵依賴性的，區(qū)別于細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬的新型的細胞程序性死亡方式。鐵死亡的的本質(zhì)是谷胱甘肽的耗竭，谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）活性下降，脂質(zhì)氧化物不能通過GPX4催化的谷胱甘肽還原酶反應(yīng)代謝，之后二價的鐵離子氧化脂質(zhì)產(chǎn)生活性氧，從而促使鐵死亡的發(fā)生。下圖為2023年鐵死亡中標項目：

         三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer, TNBC)是一種生物學(xué)和臨床異質(zhì)性疾病，約占已診斷乳腺癌的 15%，仍然是最難治療的乳腺癌亞型。作者之前的工作描述了中國人群中 TNBCs在分子特征、代謝重編程和腫瘤微環(huán)境方面的異質(zhì)性?；谶@些發(fā)現(xiàn)，作者提出了一個穩(wěn)健的 TNBC分型系統(tǒng)，包括四種亞型:間充質(zhì)樣(MES)、管腔雄激素受體(LAR)、免疫調(diào)節(jié)(IM)和基底樣和免疫抑制(BLIS)亞型。因為 TNBC是一種富含鐵和脂質(zhì)的腫瘤，誘導(dǎo)鐵死亡是一種可探索的治療策略。重要的是，干預(yù)脂質(zhì)代謝或氧化還原平衡可誘導(dǎo)多種癌癥的鐵死亡。然而，最近乳腺癌背景下的鐵死亡研究主要集中在探索調(diào)節(jié)鐵死亡的新分子和新型納米顆粒的開發(fā)上。鑒于鐵死亡是一個逐步的過程，并受多種代謝途徑的調(diào)控，而 TNBC 中鐵死亡的清晰圖譜仍不清楚，因此在 TNBC 中利用鐵死亡進行精準治療仍有諸多阻礙。2023年3月發(fā)表在《Cell Metabolism》，IF：29。

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：

1.TNBC亞型中鐵死亡相關(guān)特征的異質(zhì)性

         作者使用了多組學(xué) TNBC數(shù)據(jù)集(n = 465)，該數(shù)據(jù)集包括360個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的樣本、279個全外顯子組測序(WES)結(jié)果的樣本、401個體細胞拷貝數(shù)改變(SCNA)數(shù)據(jù)的樣本和330個代謝組數(shù)據(jù)的樣本（圖1A和B），劃分出MES、LAR、IM和BLIS四個亞型，以評估鐵死亡特征。TNBC 在鐵死亡相關(guān)代謝產(chǎn)物和代謝途徑中具有高度異質(zhì)表型，LAR亞型中誘導(dǎo)過氧化脂質(zhì)形成等正調(diào)控鐵死亡的通路富集評分均較高，主要包括脂肪酸代謝通路、ROS代謝通路，脂肪酸過氧化酶（LOXs）相關(guān)通路（圖1C和D）。HAMP是鐵穩(wěn)態(tài)的負調(diào)節(jié)因子，在MES亞型中HAMP在mRNA水平分度較低（圖1E和F）。此外，通過鐵檢測試劑盒分析，在TNBC細胞系中驗證了MES亞型鐵代謝失調(diào)（圖1G）同時，促進鐵死亡的代謝通路也在LAR亞型中顯著上調(diào)。與其他亞型相比，LAR腫瘤的OxPE和OxPE/PE-PUFA比值較高（圖1D和H）。此外，棕櫚油酸和油酸促進細胞鐵死亡，在LAR腫瘤中表達較高。LAR亞型的脂質(zhì)過氧化水平升高也在TNBC細胞系中得到驗證（圖1I）。多組學(xué)分析和實驗均證實，LAR 亞型是TNBC 中鐵死亡活躍性最高的亞型。

圖1. TNBC亞型中鐵死亡相關(guān)特征的異質(zhì)性

2.谷胱甘肽代謝對于抑制 LAR 腫瘤的鐵死亡至關(guān)重要

         作者利用代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)探索了LAR腫瘤中抑制鐵死亡的最主要途徑。在代謝組學(xué)方面，GSH代謝被確定為LAR腫瘤中最顯著的鐵死亡抑制和可靶向的特征（圖2A和B）。GSH是癌細胞中主要的小分子抗氧化劑，由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸組成（圖2C）。通過比較GSH循環(huán)核心代謝物的豐度，作者發(fā)現(xiàn)GSH相關(guān)代謝物如甘氨酸和半胱氨酸在LAR腫瘤中顯著富集并且在TNBC細胞系中也證實了LAR亞型中GSH與氧化GSH (GSSG)的較高比例（圖2D、E、F）。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中比較 LAR和非 LAR腫瘤之間的鐵死亡抑制通路。結(jié)果表明，GSH代謝是LAR亞型鐵死亡抑制的基本途徑（圖2G）。在GSH通路的所有代謝基因中，GPX4 將LAR腫瘤與非LAR腫瘤區(qū)分開來（圖2H和I）。這些數(shù)據(jù)表明，GPX4 是 GSH代謝抑制LAR腫瘤鐵死亡的潛在決定因素。

圖2. 谷胱甘肽代謝對于抑制 LAR 腫瘤的鐵死亡至關(guān)重要

3.GPX4對多種鐵死亡誘導(dǎo)因子的敏感性突顯其在 LAR腫瘤中的重要性

         作者組裝了包括erastin、PX-12、FIN-56、RSL3 和ML162 在內(nèi)的一系列鐵死亡誘誘劑（圖3A和B），以評估每種化合物在LAR、非LAR和非TNBC細胞系中啟動鐵死亡的效果結(jié)果與之前的轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)分析一致（圖3C和D），并強調(diào)了GPX4 在LAR腫瘤鐵死亡穩(wěn)態(tài)中的重要性，并強調(diào)了GPX4 是LAR腫瘤的代謝靶點。

圖3. GPX4對多種鐵死亡誘導(dǎo)因子的敏感性突顯其在 LAR腫瘤中的重要性

4.AR 與 GPX4 啟動子結(jié)合并驅(qū)動其表達，是 LAR腫瘤中 GPX4 表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

         作者進行了整合基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，并確定LAR特異性改變與GPX4表達之間的相關(guān)性（圖4A）。在LAR腫瘤中，GSEA證明了標志基因集中的幾種途徑的激活，如FA代謝、雄激素反應(yīng)和過氧化物酶體途徑（圖4B）?；蚪M分析顯示，在LAR腫瘤中，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶(PI3K)信號通路、受體酪氨酸激酶(RTK)信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的突變以及缺失9p21.3、9p24.2和18q11.2得到富集（圖4C）。Spearman相關(guān)分析顯示，F(xiàn)A代謝、膽汁酸代謝、雄激素反應(yīng)、脂肪生成、膽固醇穩(wěn)態(tài)、PI3K信號突變、MAPK信號突變、溶質(zhì)載體家族1成員1 (SLC1A1)表達與GPX4表達呈正相關(guān)（圖4E）。

         接下來，我們進行了實驗來驗證這些轉(zhuǎn)錄組和基因組改變對GPX4的影響。鑒于膽汁酸代謝、FA代謝、脂肪生成和膽固醇代謝密切與AR信號通路密切相關(guān)。測試了bicalutamide(一種AR抑制劑)、tamoxifen(一種雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、apitolisb(一種PI3K抑制劑)、ulixertinib(一種MAPK抑制劑)和RSL3在蛋白水平上對GPX4表達的影響。在所有抑制劑中，只有AR抑制劑比卡魯胺和GPX4抑制劑RSL3明顯降低GPX4蛋白（圖4F）。此外，我們證實了AR在HEK293T細胞中的過表達導(dǎo)致GPX4 mRNA和蛋白水平表達降低，MDA-MB-453和MFM223在細胞中，抑制AR表達導(dǎo)致GPX4 mRNA和蛋白水平表達降低（圖4G和H）。接下來，我們探討了AR調(diào)控GPX4的機制。首先使用包含GPX4轉(zhuǎn)錄起始位點上游五個區(qū)域的瞬時轉(zhuǎn)染報告基因構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)錄分析Flag-AR共轉(zhuǎn)染后，只有2500至2000-bp區(qū)域上調(diào)熒光素酶信號（圖4I）。對該區(qū)域的AR結(jié)合位點進行掃描，確定了四個基序（圖4J）。這些基序的突變(ABS1/2/3/4-Del和all-ABSs-Del)阻斷了AR誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)（圖4 K）。

圖4.  AR 與 GPX4 啟動子結(jié)合并驅(qū)動其表達，是 LAR腫瘤中 GPX4 表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

5.對于 LAR患者，靶向 GPX4 是比靶向 AR 更好的策略

         考慮到GPX4是LAR腫瘤鐵死亡的潛在抑制因子，AR驅(qū)動GPX4的表達，我們想知道AR抑制劑是否促進鐵死亡并作為LAR腫瘤患者的最佳治療方法。然而，AR抑制劑單藥治療或與PI3K抑制劑和CDK4/6抑制劑聯(lián)合使用在幾項臨床試驗中顯示出次優(yōu)效果，包括MDV3100-11、TBCRC032和FUTURE試驗

         這些數(shù)據(jù)表明，LAR腫瘤中的未知機制使它們在AR抑制后能夠逃避鐵死亡。接下來，作者確定了AR在LAR腫瘤細胞系鐵死亡中的作用。用比卡魯胺（靶向細胞核中的雄激素相關(guān)元件）、達魯胺（靶向 AR 核易位）、恩雜魯胺（靶向 AR 核易位）處理 MFM-223和MDA-MB-453細胞后，通過免疫印跡、脂質(zhì)過氧化測定和 BODIPY 581/591 C11 染色分析了鐵死亡。（圖5A和5B）所示，GPX4抑制劑而不是AR抑制劑擴大了脂質(zhì)過氧化水平并促進了鐵死亡。我們進一步探討了AR抑制劑在促進鐵死亡方面無效的可能機制。既往研究表明，AR可以通過下調(diào)2,4-二烯酰輔酶A還原酶（DECR1）來促進FA代謝，尤其是PUFA的積累，DECR1是一種直接雄激素抑制的基因，我們還驗證了 LAR 腫瘤中 DECR1和OxPE 1之間的負相關(guān)關(guān)系，以及通過在 LAR 細胞系中使用 AR 抑制劑來上調(diào)DECR1（圖5C和5D）。此外，我們驗證了MDA（脂質(zhì)過氧化的生物標志物）在暴露于GPX4抑制劑而非AR抑制劑后上調(diào)（圖5C）。這些數(shù)據(jù)證明了AR在鐵死亡中的多重作用。一方面，AR可能促進PUFA生物合成，支持鐵死亡。另一方面，AR 可能上調(diào) GPX4 的表達以清除鐵死亡過程中的脂質(zhì)過氧化（圖 5E）。因此，GPX4 抑制（而非 AR 抑制）是刺激 LAR 腫瘤患者鐵死亡的最佳方法。

圖5. 對于 LAR患者，靶向 GPX4 是比靶向 AR 更好的策略

6.GPX4 抑制劑抑制腫瘤生長，并在體內(nèi)重編程腫瘤微環(huán)境

         接下來，我們進行了體內(nèi)實驗，以探索基于亞型特異性鐵死亡活性的LAR腫瘤患者的治療策略。首先，在體內(nèi)評估GPX4抑制劑在表達AR的TNBC腫瘤中的抗癌作用。我們選擇了小鼠 LAR 腫瘤細胞系 TS/A，因為該細胞系富含鐵死亡相關(guān)通路，并在我們最近的研究中被確定為 LAR 亞型（ 圖6A）. 我們在 TS/A 細胞中穩(wěn)定表達 shGpx4 或 shNC，并通過注射建立原位模型5細胞進入小鼠（圖S5A）。注射有shNC細胞系的兩組小鼠用兩種不同的GPX4抑制劑處理，而其他組用DMSO作為對照處理（圖6B）。如圖 6C、6D、S5B 和 S5C 所示，敲低 Gpx4 表達或添加 GPX4 抑制劑顯著誘導(dǎo)腫瘤鐵死亡，但不誘導(dǎo)細胞凋亡。最近的研究表明，鐵死亡誘導(dǎo)的納米顆粒抑制腫瘤生長并增強抗癌免疫力。因此，作者研究了Gpx4 敲低或利用 GPX4 抑制劑對腫瘤微環(huán)境的影響。如圖 6D 所示，IHC 染色表明 GPX4 抑制有效導(dǎo)致藥物誘導(dǎo)的鐵死亡生物標志物 PTGS2、MDA 和 4-HNE 升高并募集CD3e細胞、CD4細胞、CD8細胞和CD86細胞，并減少CD206細胞的數(shù)量。相關(guān)性分析表明，GSH代謝與CD8 T細胞和M1巨噬細胞的比例呈負相關(guān)，但與M2巨噬細胞和靜息肥大細胞的比例呈正相關(guān)（圖6E）。CD3e T細胞是抗癌免疫中最重要的效應(yīng)因子，包含 CD4 T 細胞和 CD8 T 細胞亞群。巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵細胞，表現(xiàn)出殺瘤 M1 型和再生 M2 型表型。我們通過流式細胞術(shù)分析進一步評估了免疫反應(yīng)。GPX4的抑制顯著增加了CD45細胞中CD3e細胞的比例、CD45 T細胞中CD4細胞的比例、CD45 T細胞中CD8細胞的比例、CD45細胞中CD11b F4/80細胞的比例以及CD45 CD11bF4/80細胞中CD86細胞的比例，同時降低了CD45CD11bF4/80細胞中CD206細胞的比例（圖6F）。我們還使用4T1細胞衍生的異種移植模型驗證了 GPX4 抑制劑對腫瘤微環(huán)境的影響，因為4T1被稱為免疫冷腫瘤模型。這些數(shù)據(jù)表明，抑制LAR腫瘤中GPX4的表達可顯著促進鐵死亡，減緩腫瘤生長，并觸發(fā)腫瘤微環(huán)境獲得炎癥表型。

7.GPX4 抑制劑聯(lián)合 ICB 有效治療類似 LAR 的腫瘤

         為了測試GPX4抑制劑和免疫療法是否發(fā)揮協(xié)同作用，我們通過注射5×10來建立TS / A異種移植腫瘤5將TS / A小鼠乳腺癌細胞系放入每只小鼠中，并用GPX4抑制劑或DMSO加阻斷PD-1處理小鼠（圖7A）。與單藥治療相比，GPX4抑制劑和抗PD-1抗體聯(lián)合治療可顯著抑制腫瘤生長（圖7B）。此外，我們利用流式細胞術(shù)分析了治療后腫瘤的免疫反應(yīng)。與單藥治療相比，聯(lián)合治療不會導(dǎo)致額外的免疫細胞浸潤。然而，流式細胞術(shù)的結(jié)果表明，聯(lián)合療法誘導(dǎo)了明顯的免疫反應(yīng)，增加了PRF1CD8 T細胞和GZMBCD8 T細胞的比例（圖7C）。

         接下來，作者研究了兩個隊列中LAR亞型對GSH代謝的抑制作用是否與ICB的臨床反應(yīng)相關(guān)。在 I-SPY2 隊列中，21例 TNBC患者接受了新輔助免疫治療，并進行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析具有較高AR表達的TNBC顯示出增強的鐵代謝，不飽和FA代謝和GSH代謝活性（圖7E）。我們驗證了GSH代謝與腫瘤炎癥特征、STAT1特征、IFN-γ特征、PD-1表達、PD-L1表達和M1型巨噬細胞比例呈負相關(guān)，但與AR高TNBC腫瘤中M2型巨噬細胞比例呈正相關(guān)（圖7F）。此外，GSH代謝的增加與AR高亞組缺乏病理完全緩解（pCR）有關(guān)（圖7G）。在TNBC小鼠模型中的另一組抗PD1和抗CTLA-4聯(lián)合治療中，我們注意到類似的結(jié)果。具有較高AR表達的腫瘤也顯示出與LAR腫瘤相似的生物學(xué)特征（圖7H和7I）。在第一個隊列中，GSH代謝與AR高亞組中的免疫相關(guān)生物標志物呈負相關(guān)（圖7J）。通過將 GPX4 表達與單個小鼠細胞系對免疫治療的反應(yīng)進行比較，我們發(fā)現(xiàn) ICB 耐藥組表達 GPX4 的水平更高（圖7K）?？傊?，我們的研究表明，GPX4抑制劑與ICB的聯(lián)合治療在生物學(xué)特征上類似于LAR的腫瘤是最佳療法。

圖7.GPX4 抑制劑聯(lián)合 ICB 有效治療類似 LAR 的腫瘤

結(jié)論：

         總之，該研究展示了TNBC的鐵死亡的高度異質(zhì)性，并揭示了難治性LAR腫瘤的一種新型免疫治療聯(lián)合策略，將有望給LAR型TNBC患者帶來新希望。該研究提出通過多組學(xué)融合分析全面揭示鐵死亡特征和鑒定關(guān)鍵調(diào)控因子的思路，是研究腫瘤鐵死亡的新模式，在腫瘤鐵死亡研究和TNBC臨床治療領(lǐng)域均具有重要意義。

實驗方法：

         異種移植模型、類器官培養(yǎng)、基因集富集分析（GSEA）、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、免疫印跡分析、實時熒光定量PCR（qPCR）和ChIP–qPCR、脂質(zhì)過氧化試驗、GSH/GSSG比值測定、鐵測定、熒光素酶檢測、流式細胞術(shù)分析、免疫組化染色和H&E染色。

參考文獻：

         Yang F, Xiao Y, Ding JH, et al. Ferroptosis heterogeneity in triple-negative breast cancer reveals an innovative immunotherapy combination strategy. Cell Metab. 2023;35(1):84-100.e8.