scRNA-seq和scATAC-seq整合分析發(fā)高分——揭示iNKT細(xì)胞發(fā)育軌跡

         與傳統(tǒng)的αβT細(xì)胞不同，固有自然殺傷T細(xì)胞（iNKT細(xì)胞）在胸腺中完成其終末分化為功能性的iNKT1/2/17細(xì)胞。然而，指導(dǎo)iNKT亞群分化的潛在分子程序仍然不清楚。在這里，作者利用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座可及染色質(zhì)測序（scATAC-seq）對四個(gè)胸腺iNKT發(fā)育階段的超過17,000個(gè)iNKT細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和超過39,000個(gè)iNKT細(xì)胞的染色質(zhì)可及狀態(tài)進(jìn)行了分析，以定義它們的發(fā)育軌跡。研究發(fā)現(xiàn)了iNKT前體和不同iNKT亞群的新特征，并表明iNKT2和iNKT17細(xì)胞系的發(fā)育可能在第0階段（ST0）早期就通過兩個(gè)不同的程序發(fā)生了，而iNKT1的發(fā)育可能發(fā)生在ST0之后。iNKT1和iNKT2細(xì)胞都表現(xiàn)出廣泛的表型和功能多樣性，而iNKT17細(xì)胞相對均一。此外，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子Cbfβ在iNKT前體中高表達(dá)，其表達(dá)軌跡與其他已知的iNKT細(xì)胞發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子Zbtb16和Egr2相似，并且可以指導(dǎo)iNKT細(xì)胞命運(yùn)并推動它們的效應(yīng)器表型分化。通過條件性敲除Cbfβ，阻斷了早期iNKT細(xì)胞的發(fā)育，并導(dǎo)致iNKT1/2/17細(xì)胞分化嚴(yán)重受損?？偟膩碚f，本研究揭示了不同的iNKT發(fā)育程序以及它們的細(xì)胞多樣性，并確定了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子Cbfβ作為早期iNKT細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本文于2023年6月發(fā)表在《Cell Discovery》IF: 33.5期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、通過scRNA-seq和scATAC-seq對胸腺iNKT細(xì)胞在連續(xù)發(fā)育階段進(jìn)行聚類

         為揭示iNKT細(xì)胞的發(fā)育景觀，采用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)從連續(xù)發(fā)育階段中收集胸腺iNKT細(xì)胞，以進(jìn)行scRNA-seq和scATAC-seq實(shí)驗(yàn)（圖1a，b）。鑒于在C57BL/6小鼠中胸腺ST0（CD24+） iNKT細(xì)胞的稀缺性，利用Vα14-Jα18轉(zhuǎn)基因小鼠（也稱為rec-Vα14Tg）進(jìn)行ST0 iNKT細(xì)胞分析，其TCR基因座與內(nèi)源性TCR基因座非常相似，但具有豐富的ST0 iNKT細(xì)胞。如預(yù)期的，發(fā)現(xiàn)在rec-Vα14Tg和C57BL/6小鼠的ST0 iNKT細(xì)胞中，scATAC-seq譜的相似性很高。因此，進(jìn)一步使用rec-Vα14Tg小鼠進(jìn)行ST0 iNKT細(xì)胞的scRNA-seq分析，并使用C57BL/6小鼠進(jìn)行ST1（CD24?CD44loNK1.1?）、ST2（CD24?CD44hiNK1.1?）和ST3（CD24?CD44hiNK1.1+） iNKT細(xì)胞的分析（圖1a–c）。

         經(jīng)過質(zhì)量控制過濾和排除細(xì)胞異常值后，共保留了17,944個(gè)高質(zhì)量的單一胸腺iNKT細(xì)胞，總共表達(dá)了13,578個(gè)基因，用于隨后的scRNA-seq分析。在聚合的iNKT細(xì)胞（ST0–ST3）中鑒定16個(gè)簇，每個(gè)簇的細(xì)胞數(shù)量從255個(gè)到2817個(gè)不等（圖1d，e）。每個(gè)簇中最顯著差異表達(dá)的基因（DEGs）顯示在熱圖中（圖1f）和小提琴圖中（圖1g）。在這些簇中，有四個(gè)簇（C2，C4，C9和C14）來自ST0，八個(gè)簇來自ST1（C3，C5，C6，C7，C10，C11，C15和C16），九個(gè)簇來自ST2（C1，C3，C5，C6，C7，C10，C11，C13和C15），以及四個(gè)簇來自ST3（C1，C5，C8和C12）（圖1d）。ST0 iNKT細(xì)胞明顯與其他iNKT階段分離，而來自ST1和ST2 iNKT細(xì)胞的簇有適度的重疊，而來自ST3 iNKT細(xì)胞的簇與來自ST2 iNKT細(xì)胞的簇緊密相鄰（圖1d）。此外，相關(guān)性分析表明，同一階段內(nèi)的不同簇呈相對相似的轉(zhuǎn)錄組模式。

圖1 小鼠胸腺iNKT細(xì)胞的多樣性

         細(xì)胞分化伴隨著由順式調(diào)控元件控制的基因的表達(dá)，這些元件必須處于開放狀態(tài)才能正常發(fā)揮功能。因此，對與scRNA-seq分析中相同發(fā)育階段的胸腺iNKT細(xì)胞進(jìn)行了scATAC-seq分析，并繪制了單個(gè)iNKT細(xì)胞的染色質(zhì)可及性景觀。在與scRNA-seq數(shù)據(jù)整合后，這十六個(gè)iNKT細(xì)胞簇很容易識別（圖2a）。由于scRNA-seq允許根據(jù)轉(zhuǎn)錄組推測當(dāng)前細(xì)胞狀態(tài)，作者根據(jù)其特征轉(zhuǎn)錄組和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，將每個(gè)簇（C1–C16）分配到已發(fā)表的iNKT1、iNKT2和iNKT17功能亞群中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自ST1和ST2的C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16簇被分類為iNKT2亞群；來自ST3主要的C1、C5、C8和C12簇被分類為iNKT1（圖2b）；而來自ST2的獨(dú)特iNKT C13被分配到iNKT17（圖2b）。ST0簇（C2、C4、C9和C14）在任何iNKT亞群中都不突出，因?yàn)樗鼈儧]有表現(xiàn)出強(qiáng)烈的效應(yīng)特征（圖2b）?？傮w而言，通過整合轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)特征，繪制了胸腺iNKT細(xì)胞的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)景觀，揭示了iNKT1和iNKT2細(xì)胞的異質(zhì)性以及iNKT17細(xì)胞的相對同質(zhì)性。

圖2 不同的iNKT簇被分配到功能子集中

2、ST0中的兩個(gè)發(fā)育軌跡

         胸腺中iNKT細(xì)胞的發(fā)育依賴于位于胸腺皮質(zhì)的大約1000個(gè)ST0 iNKT前體細(xì)胞（iNKTp）。在這里，作者鑒定了ST0中的四個(gè)簇（C2、C4、C9和C14）（圖1d和3a），并突出顯示了每個(gè)簇的特定特征（圖3b）。根據(jù)CD4和CD8的表達(dá)，這些ST0簇可以分為三組：C14是CD4+CD8+（DP）iNKTp；C9是CD4+CD8?（CD4SP）iNKTp，富含T淋巴細(xì)胞存活調(diào)節(jié)因子，包括Id2和Il7r；C2和C4是CD4?CD8?（DN）iNKTp，其中C4高度表達(dá)Cd5和Cd6，而C2 iNKTp豐富表達(dá)Egr2和Slamf6，它們分別通過調(diào)節(jié)PLZF表達(dá)和TCR信號強(qiáng)度，對iNKT細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要（圖3b–d）。盡管先前的研究聲稱iNKT細(xì)胞要么是CD4?CD8?（DN），要么是CD4+CD8?（CD4SP），但在ST0中確實(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小的CD4+CD8+（DP）iNKTp簇（C14）（圖3c–e）。

         將ST0 iNKTp組織成一個(gè)偽時(shí)間軌跡。鑒別了兩個(gè)潛在的發(fā)育分支，即C14-C2-C4分支（稱為DP-DN分支）和C14-C9分支（DP-CD4SP分支）（圖3f）。這兩個(gè)分支最終在表達(dá)趨化因子受體Ccr7增加的發(fā)育末端相遇（圖3g），Ccr7在ST0 iNKTp從胸腺皮質(zhì)遷移到髓質(zhì)中是必需的。通過流式細(xì)胞儀在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步確認(rèn)了DP、DN和CD4SP iNKTp中Ccr7的表達(dá)模式（圖3h）。因此， DP iNKTp下調(diào)CD8或同時(shí)下調(diào)CD4和CD8的表達(dá)，以啟動在胸腺皮質(zhì)中的DP-CD4SP或DP-DN發(fā)育程序，最終遷移到胸腺髓質(zhì)。

3、ST0中功性能iNKT亞型譜系

         接下來，想知道ST0中這兩個(gè)發(fā)育程序如何對iNKT亞型譜系產(chǎn)生影響。盡管PLZF被注釋為關(guān)鍵的iNKT2標(biāo)志，但它對整體iNKT細(xì)胞的發(fā)育也至關(guān)重要，包括iNKT1和iNKT17細(xì)胞。因此，首先評估了Zbtb16（編碼PLZF）在ST0 iNKTp中的表達(dá)模式和染色質(zhì)可及性。發(fā)現(xiàn)在DP iNKTp（C14）中，Zbtb16的+40?kb區(qū)域和TSS是不可及的，但在CD4SP（C9）和DN（C2和C4） iNKTp中是可及的，其中C2的開放性水平遠(yuǎn)高于C4，這與Zbtb16的表達(dá)模式非常相似（圖3i，j）。偽時(shí)間軌跡和流式細(xì)胞儀進(jìn)一步表明，Zbtb16在DN和CD4SP iNKTp中富集（圖3j，k）。鑒于iNKT2分化需要比iNKT1和iNKT17更強(qiáng)的TCR信號，因此CD4SP中的PLZF高表達(dá)iNKTp（C9）更有可能進(jìn)入iNKT2細(xì)胞譜系。

         RORγt是調(diào)控iNKT17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，但也高度表達(dá)于未被信號刺激的DP胸腺細(xì)胞，并促進(jìn)iNKT細(xì)胞選擇。與Zbtb16不同，在+4?kb區(qū)域的Rorc（編碼RORγt）在DP（C14）和DN（C2和C4）iNKTp中是可及的，但在CD4SP（C9）簇中不可及，而+13?kb到Rorc只在DP iNKTp（C14）中可及。Rorc的表達(dá)模式與每個(gè)簇中的染色質(zhì)可及性狀態(tài)一致（圖3l）。Rorc在DP iNKTp中顯著高表達(dá)，并在DN分支（C4和C2）中逐漸下調(diào)，但在CD4SP（C4）中幾乎不可檢測（圖3m），這在流式細(xì)胞儀中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證（圖3n）?？傮w而言，基于偽時(shí)間的發(fā)育軌跡分析揭示了ST0可能存在兩個(gè)潛在的發(fā)育程序，在這兩個(gè)程序中，iNKT細(xì)胞可能啟動對iNKT2和iNKT17細(xì)胞的發(fā)育，這早在ST0發(fā)生，而iNKT1細(xì)胞可能在ST0后啟動。然而，這一假設(shè)仍在進(jìn)一步調(diào)查中。

圖3 ST0時(shí)期iNKT細(xì)胞的細(xì)胞多樣性

4、iNKT2細(xì)胞的細(xì)胞多樣性

         為了解ST0后iNKT子集的發(fā)展，將聚集的胸腺iNKT細(xì)胞(ST0 - 3)映射到偽時(shí)間軌跡中（圖4a）。iNKT2細(xì)胞展示了廣泛的多樣性，包括C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16簇（圖2b和4a, b）。首先評估了整合的iNKT細(xì)胞簇（C1–C16）中Zbtb16染色質(zhì)的可及性。在Zbtb16位點(diǎn)的181 kb內(nèi)，發(fā)現(xiàn)iNKT2、iNKT1和iNKT17簇中高度可訪問的區(qū)域，但在ST0簇（C2、C4、C9和C14）中區(qū)域較弱。Zbtb16的表達(dá)與其染色質(zhì)可及性密切匹配（圖4c）。iNKT2簇和ST0中的C2和C9顯示了GATA3結(jié)合活性的高活性，GATA3對iNKT2分化至關(guān)重要（圖4d）。正如預(yù)期的那樣，對于iNKT2細(xì)胞的大多數(shù)標(biāo)志基因，它們在中間階段逐漸增加，然后在終端分化期間下調(diào)。然而，一些基因，包括Btg1、Cebpb和Osgin1，僅在iNKT發(fā)育末端附近出現(xiàn)，這可能與iNKT2細(xì)胞的終末事件相關(guān)（圖4e）。

         先前的研究表明，ST1和ST2中的iNKT細(xì)胞經(jīng)歷高度的增殖。細(xì)胞周期通路富集分析表明，iNKT2簇（C7、C11和C15）表現(xiàn)出高度增殖的特征，這些特征可能處于S期（C7）或G2/M期（C11和C15）（圖4f）。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）表明，簇C3、C6、C10和C16在功能上存在差異。C16是從ST0到ST1的iNKT細(xì)胞的短暫階段，這些細(xì)胞迅速上調(diào)了與糖酵解和氧化磷酸化都相關(guān)的基因的表達(dá)（圖4g），表明它們對能量的需求增加。C6在ST1中終止，這些細(xì)胞富集了與TCR信號、共刺激信號、細(xì)胞骨架、TNFR以及細(xì)胞死亡和衰竭通路相關(guān)的基因（圖4g）。總體而言，iNKT2展現(xiàn)出極大的細(xì)胞多樣性。

圖4 iNKT2細(xì)胞的細(xì)胞多樣性

5、iNKT1細(xì)胞的異質(zhì)性

         iNKT1細(xì)胞分化受轉(zhuǎn)錄因子Tbx21的調(diào)控，分為四個(gè)簇（C1、C5、C8和C12）（圖2b和5a）。在Tbx21位點(diǎn)的17.2 kb內(nèi)，啟動子區(qū)域–3 kb和–4 kb在C1、C5和C12中高度可訪問，但在C8中較不可訪問（圖5b）。這些相同的區(qū)域在ST1和ST2中的高增殖C7、C11和C15 iNKT2簇中也是可訪問的。重要的是，Tbx21結(jié)合位點(diǎn)的活性也發(fā)生在這些簇中，而在ST0簇中則不是如此（圖5c）。流式細(xì)胞儀分析進(jìn)一步證實(shí)，ST1和ST2中的PLZFhiiNKT2細(xì)胞中有一小部分表達(dá)T-bet，并且通過Ki-67測量具有相當(dāng)?shù)脑鲋衬芰Γ▓D5d）。因此，iNKT1的前體可能隱藏在這些所謂的高增殖PLZFhiT-bethi iNKT2細(xì)胞中。

         偽時(shí)間軌跡分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的標(biāo)志基因，Slamf7，在iNKT1細(xì)胞簇中富集（圖5e）。流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)，基于PLZFloT-bethi iNKT1細(xì)胞中SLAM7和NK1.1表達(dá)之間的強(qiáng)相關(guān)性（圖5f）。與其他iNKT1細(xì)胞簇相比，NK細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志基因Slamf4進(jìn)一步區(qū)分了末端的C12。SLAMF4+ iNKT細(xì)胞（C12）主要是DN，逐漸從PLZFloT-bethi iNKT1細(xì)胞中分化出來（圖5g–i）。SLAMF4+ iNKT1細(xì)胞主要分泌IFN-γ，IL-4較少，類似于“經(jīng)典iNKT1細(xì)胞”，而大多數(shù)SLAMF4? iNKT1細(xì)胞在刺激后分泌IL-4和IFN-γ（圖5j）。C5細(xì)胞富集了參與干擾素信號通路的Ifit1和Ifit3（圖5k）。總體而言，iNKT1細(xì)胞從ST1開始，起初表現(xiàn)為目前定義的“iNKT2細(xì)胞”，逐漸完成分化并最終轉(zhuǎn)化為末端的SLAMF4+ iNKT1細(xì)胞，即經(jīng)典的分泌IFN-γ的iNKT1細(xì)胞。

圖5 iNKT1細(xì)胞具有廣泛的細(xì)胞異質(zhì)性

6、iNKT17細(xì)胞表現(xiàn)出有限的多樣性

         C13被指定為iNKT17細(xì)胞，它在圖2b和6a中與其他簇明顯分開。觀察到Rorc的+4?kb和+14?kb區(qū)域在ST0簇（C2、C4和C14）和成熟的iNKT17簇（C13）中是可訪問的（圖6b），并且RORC的結(jié)合位點(diǎn)在iNKT17簇以及ST0 iNKTp中也被激活（圖6c）。這些數(shù)據(jù)表明，iNKT細(xì)胞可能在ST0開始其iNKT17分化，并在C13完成其分化。在mRNA水平上，Rorc在ST0的C14中高度表達(dá)，與Rorc的染色質(zhì)可及性一致，但在C4和C2中逐漸下調(diào)，并在C13中重新上調(diào)，表明其他轉(zhuǎn)錄因子可能靶向開放的Rocr位點(diǎn)，并在iNKT17分化過程中調(diào)控Rorc的表達(dá)。

         為追蹤iNKT17細(xì)胞的發(fā)育軌跡，進(jìn)一步在一個(gè)有序的iNKT細(xì)胞軌跡中檢查了iNKT17標(biāo)志基因，并發(fā)現(xiàn)少數(shù)iNKT17標(biāo)志基因，包括Rorc，在早期iNKTp中最初表達(dá)，然后在它們達(dá)到成熟的iNKT17之前。然而，大多數(shù)與iNKT17相關(guān)的標(biāo)志基因在iNKTp中幾乎不表達(dá)（圖6d）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的標(biāo)志基因， Aqp3，在胸腺iNKT17（PLZFintRORγt+）細(xì)胞中特異表達(dá)（圖6e，f）?？傮w而言，iNKT細(xì)胞可能在ST0啟動iNKT17分化，而這些iNKT17細(xì)胞表現(xiàn)出有限的多樣性。

圖6 iNKT17細(xì)胞表現(xiàn)出有限的異質(zhì)性

7、Cbfβ調(diào)控iNKT細(xì)胞的早期分化

         先前的研究指出，Egr2和Slamf6通過調(diào)節(jié)Zbtb16的表達(dá)和TCR在ST0中控制早期iNKT細(xì)胞的發(fā)育。在這里，作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的共轉(zhuǎn)錄因子，Cbfβ，它與Egr2和Slamf6表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，并在iNKT細(xì)胞的ST0階段表現(xiàn)出很高的富集，特別是在DP-DN分支C2中（圖7a, b）。

         Cbfβ編碼的CBFB是一個(gè)非DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)亞基，通過異構(gòu)增強(qiáng)RUNX（RUNX1、RUNX2和RUNX3）的特異性DNA結(jié)合能力，從而調(diào)節(jié)它們目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。為確定Cbfβ是否調(diào)節(jié)iNKT發(fā)育，檢查了胸腺特異性Cbfβ敲除小鼠（CD4CreCbfβ f/f，Cbfβ KO）中的iNKT細(xì)胞發(fā)育，其中Cbfβ1和Cbfβ2均被敲除。Cbfβ敲除導(dǎo)致胸腺iNKT細(xì)胞的頻率和絕對數(shù)量顯著減少（圖7c）。進(jìn)一步更全面的分析揭示了Cbfβ KO小鼠中ST2和ST3 iNKT細(xì)胞的選擇性和顯著減少。Cbfβ KO小鼠中ST0和ST1 iNKT細(xì)胞的頻率顯著增加，但在Cbfβ KO和WT對照組之間，絕對數(shù)量是可比的（圖7d）。有趣的是，在Cbfβ KO小鼠的ST0 iNKT細(xì)胞中，DP iNKTp增加（圖7e），表明Cbfβ的敲除部分阻斷了DP iNKTp向CD4SP或DN譜系的轉(zhuǎn)化。作者推測Cbfβ可能影響DP階段的iNKT細(xì)胞選擇。

         ST1 iNKT細(xì)胞經(jīng)歷迅速的增殖，并包含具有高Zbtb16編碼PLZF表達(dá)的iNKT亞群的前體。在這里，觀察到在Cbfβ KO iNKT細(xì)胞中，ST1時(shí)的PLZF表達(dá)顯著下調(diào)（圖7f）。在一個(gè)增殖標(biāo)記Ki-67上也觀察到了類似的現(xiàn)象（圖7g）。這些數(shù)據(jù)表明，Cbfβ缺乏的iNKT細(xì)胞進(jìn)入了相對靜止?fàn)顟B(tài)，無法在ST1正常上調(diào)PLZF表達(dá)。此外，在ST1中殘留的PLZF+ iNKT細(xì)胞未能共同表達(dá)T-bet以啟動iNKT1分化，也未能共同表達(dá)RORγt以啟動iNKT17分化（圖7h，i）?？傮w而言，研究表明，Cbfβ在控制ST0時(shí)的早期iNKT細(xì)胞發(fā)育、ST1/2時(shí)的iNKT細(xì)胞分化以及ST3時(shí)的最終成熟中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用（圖7j）。

圖7 Cbfβ調(diào)控iNKT細(xì)胞早期細(xì)胞譜系

 實(shí)驗(yàn)方法：

         構(gòu)建條件性敲除小鼠，流式細(xì)胞術(shù)，骨髓嵌合體移植實(shí)驗(yàn)，小鼠iNKT細(xì)胞富集和分選，qRT-PCR，WB，scRNA-seq，iNKT scRNA-seq數(shù)據(jù)集與參考文獻(xiàn)的比較分析，scATAC-seq，scRNA-seq和scATAC-Seq的整合分析

參考文獻(xiàn)：

         Wang J, Adrianto I, Subedi K, Liu T, Wu X, Yi Q, Loveless I, Yin C, Datta I, Sant'Angelo DB, Kronenberg M, Zhou L, Mi QS. Integrative scATAC-seq and scRNA-seq analyses map thymic iNKT cell development and identify Cbfβ for its commitment. Cell Discov. 2023 Jun 20;9(1):61. doi: 10.1038/s41421-023-00547-x. PMID: 37336875; PMCID: PMC10279728.