與傳統(tǒng)的αβT細(xì)胞不同,固有自然殺傷T細(xì)胞(iNKT細(xì)胞)在胸腺中完成其終末分化為功能性的iNKT1/2/17細(xì)胞。然而,指導(dǎo)iNKT亞群分化的潛在分子程序仍然不清楚。在這里,作者利用單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座可及染色質(zhì)測(cè)序(scATAC-seq)對(duì)四個(gè)胸腺iNKT發(fā)育階段的超過17,000個(gè)iNKT細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和超過39,000個(gè)iNKT細(xì)胞的染色質(zhì)可及狀態(tài)進(jìn)行了分析,以定義它們的發(fā)育軌跡。研究發(fā)現(xiàn)了iNKT前體和不同iNKT亞群的新特征,并表明iNKT2和iNKT17細(xì)胞系的發(fā)育可能在第0階段(ST0)早期就通過兩個(gè)不同的程序發(fā)生了,而iNKT1的發(fā)育可能發(fā)生在ST0之后。iNKT1和iNKT2細(xì)胞都表現(xiàn)出廣泛的表型和功能多樣性,而iNKT17細(xì)胞相對(duì)均一。此外,發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子Cbfβ在iNKT前體中高表達(dá),其表達(dá)軌跡與其他已知的iNKT細(xì)胞發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子Zbtb16和Egr2相似,并且可以指導(dǎo)iNKT細(xì)胞命運(yùn)并推動(dòng)它們的效應(yīng)器表型分化。通過條件性敲除Cbfβ,阻斷了早期iNKT細(xì)胞的發(fā)育,并導(dǎo)致iNKT1/2/17細(xì)胞分化嚴(yán)重受損。總的來說,本研究揭示了不同的iNKT發(fā)育程序以及它們的細(xì)胞多樣性,并確定了一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄因子Cbfβ作為早期iNKT細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本文于2023年6月發(fā)表在《Cell Discovery》IF: 33.5期刊上。
技術(shù)路線
主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1、通過scRNA-seq和scATAC-seq對(duì)胸腺iNKT細(xì)胞在連續(xù)發(fā)育階段進(jìn)行聚類
為揭示iNKT細(xì)胞的發(fā)育景觀,采用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)技術(shù)從連續(xù)發(fā)育階段中收集胸腺iNKT細(xì)胞,以進(jìn)行scRNA-seq和scATAC-seq實(shí)驗(yàn)(圖1a,b)。鑒于在C57BL/6小鼠中胸腺ST0(CD24+) iNKT細(xì)胞的稀缺性,利用Vα14-Jα18轉(zhuǎn)基因小鼠(也稱為rec-Vα14Tg)進(jìn)行ST0 iNKT細(xì)胞分析,其TCR基因座與內(nèi)源性TCR基因座非常相似,但具有豐富的ST0 iNKT細(xì)胞。如預(yù)期的,發(fā)現(xiàn)在rec-Vα14Tg和C57BL/6小鼠的ST0 iNKT細(xì)胞中,scATAC-seq譜的相似性很高。因此,進(jìn)一步使用rec-Vα14Tg小鼠進(jìn)行ST0 iNKT細(xì)胞的scRNA-seq分析,并使用C57BL/6小鼠進(jìn)行ST1(CD24?CD44loNK1.1?)、ST2(CD24?CD44hiNK1.1?)和ST3(CD24?CD44hiNK1.1+) iNKT細(xì)胞的分析(圖1a–c)。
經(jīng)過質(zhì)量控制過濾和排除細(xì)胞異常值后,共保留了17,944個(gè)高質(zhì)量的單一胸腺iNKT細(xì)胞,總共表達(dá)了13,578個(gè)基因,用于隨后的scRNA-seq分析。在聚合的iNKT細(xì)胞(ST0–ST3)中鑒定16個(gè)簇,每個(gè)簇的細(xì)胞數(shù)量從255個(gè)到2817個(gè)不等(圖1d,e)。每個(gè)簇中最顯著差異表達(dá)的基因(DEGs)顯示在熱圖中(圖1f)和小提琴圖中(圖1g)。在這些簇中,有四個(gè)簇(C2,C4,C9和C14)來自ST0,八個(gè)簇來自ST1(C3,C5,C6,C7,C10,C11,C15和C16),九個(gè)簇來自ST2(C1,C3,C5,C6,C7,C10,C11,C13和C15),以及四個(gè)簇來自ST3(C1,C5,C8和C12)(圖1d)。ST0 iNKT細(xì)胞明顯與其他iNKT階段分離,而來自ST1和ST2 iNKT細(xì)胞的簇有適度的重疊,而來自ST3 iNKT細(xì)胞的簇與來自ST2 iNKT細(xì)胞的簇緊密相鄰(圖1d)。此外,相關(guān)性分析表明,同一階段內(nèi)的不同簇呈相對(duì)相似的轉(zhuǎn)錄組模式。
圖1 小鼠胸腺iNKT細(xì)胞的多樣性
細(xì)胞分化伴隨著由順式調(diào)控元件控制的基因的表達(dá),這些元件必須處于開放狀態(tài)才能正常發(fā)揮功能。因此,對(duì)與scRNA-seq分析中相同發(fā)育階段的胸腺iNKT細(xì)胞進(jìn)行了scATAC-seq分析,并繪制了單個(gè)iNKT細(xì)胞的染色質(zhì)可及性景觀。在與scRNA-seq數(shù)據(jù)整合后,這十六個(gè)iNKT細(xì)胞簇很容易識(shí)別(圖2a)。由于scRNA-seq允許根據(jù)轉(zhuǎn)錄組推測(cè)當(dāng)前細(xì)胞狀態(tài),作者根據(jù)其特征轉(zhuǎn)錄組和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá),將每個(gè)簇(C1–C16)分配到已發(fā)表的iNKT1、iNKT2和iNKT17功能亞群中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自ST1和ST2的C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16簇被分類為iNKT2亞群;來自ST3主要的C1、C5、C8和C12簇被分類為iNKT1(圖2b);而來自ST2的獨(dú)特iNKT C13被分配到iNKT17(圖2b)。ST0簇(C2、C4、C9和C14)在任何iNKT亞群中都不突出,因?yàn)樗鼈儧]有表現(xiàn)出強(qiáng)烈的效應(yīng)特征(圖2b)??傮w而言,通過整合轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)特征,繪制了胸腺iNKT細(xì)胞的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)景觀,揭示了iNKT1和iNKT2細(xì)胞的異質(zhì)性以及iNKT17細(xì)胞的相對(duì)同質(zhì)性。
圖2 不同的iNKT簇被分配到功能子集中
2、ST0中的兩個(gè)發(fā)育軌跡
胸腺中iNKT細(xì)胞的發(fā)育依賴于位于胸腺皮質(zhì)的大約1000個(gè)ST0 iNKT前體細(xì)胞(iNKTp)。在這里,作者鑒定了ST0中的四個(gè)簇(C2、C4、C9和C14)(圖1d和3a),并突出顯示了每個(gè)簇的特定特征(圖3b)。根據(jù)CD4和CD8的表達(dá),這些ST0簇可以分為三組:C14是CD4+CD8+(DP)iNKTp;C9是CD4+CD8?(CD4SP)iNKTp,富含T淋巴細(xì)胞存活調(diào)節(jié)因子,包括Id2和Il7r;C2和C4是CD4?CD8?(DN)iNKTp,其中C4高度表達(dá)Cd5和Cd6,而C2 iNKTp豐富表達(dá)Egr2和Slamf6,它們分別通過調(diào)節(jié)PLZF表達(dá)和TCR信號(hào)強(qiáng)度,對(duì)iNKT細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要(圖3b–d)。盡管先前的研究聲稱iNKT細(xì)胞要么是CD4?CD8?(DN),要么是CD4+CD8?(CD4SP),但在ST0中確實(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小的CD4+CD8+(DP)iNKTp簇(C14)(圖3c–e)。
將ST0 iNKTp組織成一個(gè)偽時(shí)間軌跡。鑒別了兩個(gè)潛在的發(fā)育分支,即C14-C2-C4分支(稱為DP-DN分支)和C14-C9分支(DP-CD4SP分支)(圖3f)。這兩個(gè)分支最終在表達(dá)趨化因子受體Ccr7增加的發(fā)育末端相遇(圖3g),Ccr7在ST0 iNKTp從胸腺皮質(zhì)遷移到髓質(zhì)中是必需的。通過流式細(xì)胞儀在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步確認(rèn)了DP、DN和CD4SP iNKTp中Ccr7的表達(dá)模式(圖3h)。因此, DP iNKTp下調(diào)CD8或同時(shí)下調(diào)CD4和CD8的表達(dá),以啟動(dòng)在胸腺皮質(zhì)中的DP-CD4SP或DP-DN發(fā)育程序,最終遷移到胸腺髓質(zhì)。
3、ST0中功性能iNKT亞型譜系
接下來,想知道ST0中這兩個(gè)發(fā)育程序如何對(duì)iNKT亞型譜系產(chǎn)生影響。盡管PLZF被注釋為關(guān)鍵的iNKT2標(biāo)志,但它對(duì)整體iNKT細(xì)胞的發(fā)育也至關(guān)重要,包括iNKT1和iNKT17細(xì)胞。因此,首先評(píng)估了Zbtb16(編碼PLZF)在ST0 iNKTp中的表達(dá)模式和染色質(zhì)可及性。發(fā)現(xiàn)在DP iNKTp(C14)中,Zbtb16的+40?kb區(qū)域和TSS是不可及的,但在CD4SP(C9)和DN(C2和C4) iNKTp中是可及的,其中C2的開放性水平遠(yuǎn)高于C4,這與Zbtb16的表達(dá)模式非常相似(圖3i,j)。偽時(shí)間軌跡和流式細(xì)胞儀進(jìn)一步表明,Zbtb16在DN和CD4SP iNKTp中富集(圖3j,k)。鑒于iNKT2分化需要比iNKT1和iNKT17更強(qiáng)的TCR信號(hào),因此CD4SP中的PLZF高表達(dá)iNKTp(C9)更有可能進(jìn)入iNKT2細(xì)胞譜系。
RORγt是調(diào)控iNKT17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,但也高度表達(dá)于未被信號(hào)刺激的DP胸腺細(xì)胞,并促進(jìn)iNKT細(xì)胞選擇。與Zbtb16不同,在+4?kb區(qū)域的Rorc(編碼RORγt)在DP(C14)和DN(C2和C4)iNKTp中是可及的,但在CD4SP(C9)簇中不可及,而+13?kb到Rorc只在DP iNKTp(C14)中可及。Rorc的表達(dá)模式與每個(gè)簇中的染色質(zhì)可及性狀態(tài)一致(圖3l)。Rorc在DP iNKTp中顯著高表達(dá),并在DN分支(C4和C2)中逐漸下調(diào),但在CD4SP(C4)中幾乎不可檢測(cè)(圖3m),這在流式細(xì)胞儀中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證(圖3n)??傮w而言,基于偽時(shí)間的發(fā)育軌跡分析揭示了ST0可能存在兩個(gè)潛在的發(fā)育程序,在這兩個(gè)程序中,iNKT細(xì)胞可能啟動(dòng)對(duì)iNKT2和iNKT17細(xì)胞的發(fā)育,這早在ST0發(fā)生,而iNKT1細(xì)胞可能在ST0后啟動(dòng)。然而,這一假設(shè)仍在進(jìn)一步調(diào)查中。
圖3 ST0時(shí)期iNKT細(xì)胞的細(xì)胞多樣性
4、iNKT2細(xì)胞的細(xì)胞多樣性
為了解ST0后iNKT子集的發(fā)展,將聚集的胸腺iNKT細(xì)胞(ST0 - 3)映射到偽時(shí)間軌跡中(圖4a)。iNKT2細(xì)胞展示了廣泛的多樣性,包括C3、C6、C7、C10、C11、C15和C16簇(圖2b和4a, b)。首先評(píng)估了整合的iNKT細(xì)胞簇(C1–C16)中Zbtb16染色質(zhì)的可及性。在Zbtb16位點(diǎn)的181 kb內(nèi),發(fā)現(xiàn)iNKT2、iNKT1和iNKT17簇中高度可訪問的區(qū)域,但在ST0簇(C2、C4、C9和C14)中區(qū)域較弱。Zbtb16的表達(dá)與其染色質(zhì)可及性密切匹配(圖4c)。iNKT2簇和ST0中的C2和C9顯示了GATA3結(jié)合活性的高活性,GATA3對(duì)iNKT2分化至關(guān)重要(圖4d)。正如預(yù)期的那樣,對(duì)于iNKT2細(xì)胞的大多數(shù)標(biāo)志基因,它們?cè)谥虚g階段逐漸增加,然后在終端分化期間下調(diào)。然而,一些基因,包括Btg1、Cebpb和Osgin1,僅在iNKT發(fā)育末端附近出現(xiàn),這可能與iNKT2細(xì)胞的終末事件相關(guān)(圖4e)。
先前的研究表明,ST1和ST2中的iNKT細(xì)胞經(jīng)歷高度的增殖。細(xì)胞周期通路富集分析表明,iNKT2簇(C7、C11和C15)表現(xiàn)出高度增殖的特征,這些特征可能處于S期(C7)或G2/M期(C11和C15)(圖4f)。Ingenuity Pathway Analysis(IPA)表明,簇C3、C6、C10和C16在功能上存在差異。C16是從ST0到ST1的iNKT細(xì)胞的短暫階段,這些細(xì)胞迅速上調(diào)了與糖酵解和氧化磷酸化都相關(guān)的基因的表達(dá)(圖4g),表明它們對(duì)能量的需求增加。C6在ST1中終止,這些細(xì)胞富集了與TCR信號(hào)、共刺激信號(hào)、細(xì)胞骨架、TNFR以及細(xì)胞死亡和衰竭通路相關(guān)的基因(圖4g)??傮w而言,iNKT2展現(xiàn)出極大的細(xì)胞多樣性。
圖4 iNKT2細(xì)胞的細(xì)胞多樣性
5、iNKT1細(xì)胞的異質(zhì)性
iNKT1細(xì)胞分化受轉(zhuǎn)錄因子Tbx21的調(diào)控,分為四個(gè)簇(C1、C5、C8和C12)(圖2b和5a)。在Tbx21位點(diǎn)的17.2 kb內(nèi),啟動(dòng)子區(qū)域–3 kb和–4 kb在C1、C5和C12中高度可訪問,但在C8中較不可訪問(圖5b)。這些相同的區(qū)域在ST1和ST2中的高增殖C7、C11和C15 iNKT2簇中也是可訪問的。重要的是,Tbx21結(jié)合位點(diǎn)的活性也發(fā)生在這些簇中,而在ST0簇中則不是如此(圖5c)。流式細(xì)胞儀分析進(jìn)一步證實(shí),ST1和ST2中的PLZFhiiNKT2細(xì)胞中有一小部分表達(dá)T-bet,并且通過Ki-67測(cè)量具有相當(dāng)?shù)脑鲋衬芰Γ▓D5d)。因此,iNKT1的前體可能隱藏在這些所謂的高增殖PLZFhiT-bethi iNKT2細(xì)胞中。
偽時(shí)間軌跡分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的標(biāo)志基因,Slamf7,在iNKT1細(xì)胞簇中富集(圖5e)。流式細(xì)胞儀進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn),基于PLZFloT-bethi iNKT1細(xì)胞中SLAM7和NK1.1表達(dá)之間的強(qiáng)相關(guān)性(圖5f)。與其他iNKT1細(xì)胞簇相比,NK細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志基因Slamf4進(jìn)一步區(qū)分了末端的C12。SLAMF4+ iNKT細(xì)胞(C12)主要是DN,逐漸從PLZFloT-bethi iNKT1細(xì)胞中分化出來(圖5g–i)。SLAMF4+ iNKT1細(xì)胞主要分泌IFN-γ,IL-4較少,類似于“經(jīng)典iNKT1細(xì)胞”,而大多數(shù)SLAMF4? iNKT1細(xì)胞在刺激后分泌IL-4和IFN-γ(圖5j)。C5細(xì)胞富集了參與干擾素信號(hào)通路的Ifit1和Ifit3(圖5k)??傮w而言,iNKT1細(xì)胞從ST1開始,起初表現(xiàn)為目前定義的“iNKT2細(xì)胞”,逐漸完成分化并最終轉(zhuǎn)化為末端的SLAMF4+ iNKT1細(xì)胞,即經(jīng)典的分泌IFN-γ的iNKT1細(xì)胞。
圖5 iNKT1細(xì)胞具有廣泛的細(xì)胞異質(zhì)性
6、iNKT17細(xì)胞表現(xiàn)出有限的多樣性
C13被指定為iNKT17細(xì)胞,它在圖2b和6a中與其他簇明顯分開。觀察到Rorc的+4?kb和+14?kb區(qū)域在ST0簇(C2、C4和C14)和成熟的iNKT17簇(C13)中是可訪問的(圖6b),并且RORC的結(jié)合位點(diǎn)在iNKT17簇以及ST0 iNKTp中也被激活(圖6c)。這些數(shù)據(jù)表明,iNKT細(xì)胞可能在ST0開始其iNKT17分化,并在C13完成其分化。在mRNA水平上,Rorc在ST0的C14中高度表達(dá),與Rorc的染色質(zhì)可及性一致,但在C4和C2中逐漸下調(diào),并在C13中重新上調(diào),表明其他轉(zhuǎn)錄因子可能靶向開放的Rocr位點(diǎn),并在iNKT17分化過程中調(diào)控Rorc的表達(dá)。
為追蹤iNKT17細(xì)胞的發(fā)育軌跡,進(jìn)一步在一個(gè)有序的iNKT細(xì)胞軌跡中檢查了iNKT17標(biāo)志基因,并發(fā)現(xiàn)少數(shù)iNKT17標(biāo)志基因,包括Rorc,在早期iNKTp中最初表達(dá),然后在它們達(dá)到成熟的iNKT17之前。然而,大多數(shù)與iNKT17相關(guān)的標(biāo)志基因在iNKTp中幾乎不表達(dá)(圖6d)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的標(biāo)志基因, Aqp3,在胸腺iNKT17(PLZFintRORγt+)細(xì)胞中特異表達(dá)(圖6e,f)??傮w而言,iNKT細(xì)胞可能在ST0啟動(dòng)iNKT17分化,而這些iNKT17細(xì)胞表現(xiàn)出有限的多樣性。
圖6 iNKT17細(xì)胞表現(xiàn)出有限的異質(zhì)性
7、Cbfβ調(diào)控iNKT細(xì)胞的早期分化
先前的研究指出,Egr2和Slamf6通過調(diào)節(jié)Zbtb16的表達(dá)和TCR在ST0中控制早期iNKT細(xì)胞的發(fā)育。在這里,作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的共轉(zhuǎn)錄因子,Cbfβ,它與Egr2和Slamf6表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式,并在iNKT細(xì)胞的ST0階段表現(xiàn)出很高的富集,特別是在DP-DN分支C2中(圖7a, b)。
Cbfβ編碼的CBFB是一個(gè)非DNA結(jié)合的調(diào)節(jié)亞基,通過異構(gòu)增強(qiáng)RUNX(RUNX1、RUNX2和RUNX3)的特異性DNA結(jié)合能力,從而調(diào)節(jié)它們目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。為確定Cbfβ是否調(diào)節(jié)iNKT發(fā)育,檢查了胸腺特異性Cbfβ敲除小鼠(CD4CreCbfβ f/f,Cbfβ KO)中的iNKT細(xì)胞發(fā)育,其中Cbfβ1和Cbfβ2均被敲除。Cbfβ敲除導(dǎo)致胸腺iNKT細(xì)胞的頻率和絕對(duì)數(shù)量顯著減少(圖7c)。進(jìn)一步更全面的分析揭示了Cbfβ KO小鼠中ST2和ST3 iNKT細(xì)胞的選擇性和顯著減少。Cbfβ KO小鼠中ST0和ST1 iNKT細(xì)胞的頻率顯著增加,但在Cbfβ KO和WT對(duì)照組之間,絕對(duì)數(shù)量是可比的(圖7d)。有趣的是,在Cbfβ KO小鼠的ST0 iNKT細(xì)胞中,DP iNKTp增加(圖7e),表明Cbfβ的敲除部分阻斷了DP iNKTp向CD4SP或DN譜系的轉(zhuǎn)化。作者推測(cè)Cbfβ可能影響DP階段的iNKT細(xì)胞選擇。
ST1 iNKT細(xì)胞經(jīng)歷迅速的增殖,并包含具有高Zbtb16編碼PLZF表達(dá)的iNKT亞群的前體。在這里,觀察到在Cbfβ KO iNKT細(xì)胞中,ST1時(shí)的PLZF表達(dá)顯著下調(diào)(圖7f)。在一個(gè)增殖標(biāo)記Ki-67上也觀察到了類似的現(xiàn)象(圖7g)。這些數(shù)據(jù)表明,Cbfβ缺乏的iNKT細(xì)胞進(jìn)入了相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài),無法在ST1正常上調(diào)PLZF表達(dá)。此外,在ST1中殘留的PLZF+ iNKT細(xì)胞未能共同表達(dá)T-bet以啟動(dòng)iNKT1分化,也未能共同表達(dá)RORγt以啟動(dòng)iNKT17分化(圖7h,i)??傮w而言,研究表明,Cbfβ在控制ST0時(shí)的早期iNKT細(xì)胞發(fā)育、ST1/2時(shí)的iNKT細(xì)胞分化以及ST3時(shí)的最終成熟中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用(圖7j)。
圖7 Cbfβ調(diào)控iNKT細(xì)胞早期細(xì)胞譜系
實(shí)驗(yàn)方法:
構(gòu)建條件性敲除小鼠,流式細(xì)胞術(shù),骨髓嵌合體移植實(shí)驗(yàn),小鼠iNKT細(xì)胞富集和分選,qRT-PCR,WB,scRNA-seq,iNKT scRNA-seq數(shù)據(jù)集與參考文獻(xiàn)的比較分析,scATAC-seq,scRNA-seq和scATAC-Seq的整合分析
參考文獻(xiàn):
Wang J, Adrianto I, Subedi K, Liu T, Wu X, Yi Q, Loveless I, Yin C, Datta I, Sant'Angelo DB, Kronenberg M, Zhou L, Mi QS. Integrative scATAC-seq and scRNA-seq analyses map thymic iNKT cell development and identify Cbfβ for its commitment. Cell Discov. 2023 Jun 20;9(1):61. doi: 10.1038/s41421-023-00547-x. PMID: 37336875; PMCID: PMC10279728.