ZDHHC5對(duì)下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞PKCδ的棕櫚?；饔檬侵靖沃委煱悬c(diǎn)

        下丘腦通過神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)在控制脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮重要作用。然而，目前在下丘腦中還沒有能夠有效改善人類脂質(zhì)代謝的藥物靶點(diǎn)。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)抗瘧藥物蒿甲醚（ART）通過特異性抑制高脂飲食誘導(dǎo)小鼠下丘腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，顯著改善脂質(zhì)代謝。從機(jī)制上講，ART保護(hù)小膠質(zhì)細(xì)胞周圍的促甲狀腺激素釋放激素（TRH）神經(jīng)元免受炎癥損傷，并促進(jìn)TRH釋放到外周循環(huán)中。因此，TRH刺激甲狀腺激素（TH）的合成，從而顯著改善肝臟脂質(zhì)紊亂。隨后，作者使用生物素標(biāo)記的ART化學(xué)探針來鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞中的直接細(xì)胞靶點(diǎn)為蛋白激酶Cδ（PKCδ）。重要的是，ART直接靶向PKCδ，通過阻斷鋅指DHHC型棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶5（ZDHHC5）的結(jié)合來抑制其棕櫚?；揎棧瑥亩种葡掠紊窠?jīng)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)。在體內(nèi)，下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞特異性PKCδ敲低顯著損害了小鼠ART依賴性神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝改善。此外，人腦組織中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞中PKCδ的水平與高脂血癥患者呈正相關(guān)，從而突出了臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。總之，這些數(shù)據(jù)表明，下丘腦中小膠質(zhì)細(xì)胞PKCδ的棕櫚酰化通過下丘腦-肝臟通訊調(diào)節(jié)外周脂質(zhì)代謝，并為脂肪肝疾病提供了一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)。該研究于2024年1月發(fā)表在《Theranostics》，IF 12.4。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1 藥物再定位確定抗瘧藥物ART是一種降脂劑

        藥物重新定位是開發(fā)代謝性疾病新療法的一種很有前途的策略，從而改善傳統(tǒng)藥物的開發(fā)。HFD喂養(yǎng)的小鼠被用作研究脂質(zhì)代謝的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，特別關(guān)注脂質(zhì)代謝紊亂。為了探討抗瘧藥物ART是否能減輕HFD誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂，C57BL/6J小鼠接受對(duì)照飲食或HFD治療5周（圖1A）。如圖1B-1D所示，HFD治療顯著提高了血清總膽固醇（TC）、總甘油酯（TG）和非高密度脂蛋白膽固醇（non-HDL-C）水平，而ART以劑量依賴性方式抑制了這些水平。此外，油紅O染色顯示，HFD處理促進(jìn)肝中脂滴的積聚，ART顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（圖1E）。H&E染色還顯示ART改善了脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)的脂肪變性（圖1F）。此外，定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）分析顯示，在接受ART治療的受試者的肝臟中，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，即肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（Cpt1a）和過氧化物酶體增殖物激活受體α（Ppara）的表達(dá)顯著增加。此外，脂質(zhì)合成基因的表達(dá)，硬脂酰輔酶A去飽和酶1（Scd1），通過HFD治療上調(diào)的在口服ART后被觀察到下調(diào)（圖1G）。在脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的情況下觀察到類似的模式。ART的給藥顯著增加了CPT1A和PPARA蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制了SCD1蛋白的表達(dá)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)ART明顯降低了血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷氨酰胺草乙酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，并使肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性和丙二醛（MDA）水平正常化，證實(shí)明顯的保肝作用（圖1H-1I）。為了驗(yàn)證ART對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂的作用，作者使用另一種Balb/c小鼠來測(cè)試之前的觀察結(jié)果。在這里，作者發(fā)現(xiàn)ART對(duì)脂質(zhì)代謝表現(xiàn)出類似的改善作用，包括血脂水平、肝臟脂質(zhì)積聚、脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和氧化應(yīng)激?？傊@些結(jié)果表明ART是一種有效的降脂劑，可以改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂。

圖1：ART抑制HFD喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂

2 ART通過激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)改善肝臟脂質(zhì)紊亂

        為研究ART如何調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，作者建立了棕櫚酸（PA）或油酸（OA）誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞（LO2）模型。尼羅紅染色顯示，PA或OA處理明顯促進(jìn)LO2細(xì)胞中的脂質(zhì)積累，但ART并不能阻止這些變化。類似的觀察結(jié)果表明，ART沒有阻斷PA或OA誘導(dǎo)的人HepG2細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚。此外，ART對(duì)PA誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞中Cpt1a和Ppara基因表達(dá)沒有顯著影響。為進(jìn)一步深入了解ART對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響，作者使用原代肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示，當(dāng)接受PA或OA治療時(shí)，ART不會(huì)增強(qiáng)Cpt1a和Ppara基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，這些結(jié)果表明ART劑量不能直接調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝。

        先前的研究表明，小腸上皮細(xì)胞的攝取和吸收與脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)展有關(guān)。為闡明ART是否影響小腸上皮細(xì)胞的攝取，作者進(jìn)行了Caco-2轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。他們發(fā)現(xiàn)硬脂酸（SA）、PA、OA和膽固醇（CHO）從心尖（AP）轉(zhuǎn)運(yùn)到基底外側(cè)（BL），不受ART的影響。這些結(jié)果表明ART劑量不干擾腸道吸收。此外，ART對(duì)體重和食物攝入量沒有明顯影響。

        接下來，作者尋找ART介導(dǎo)的降脂作用的其他潛在機(jī)制。據(jù)報(bào)道，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)在調(diào)節(jié)能量代謝中起著至關(guān)重要的作用，因此作者假設(shè)ART通過調(diào)節(jié)激素分泌改善脂質(zhì)代謝。首先，作者檢測(cè)了脂質(zhì)代謝相關(guān)激素的釋放，包括腎上腺素、胰島素和胰高血糖素。在這里，ART并沒有顯著調(diào)節(jié)這些激素的水平。此外，研究結(jié)果顯示，在接受ART治療后，喂食HFD小鼠PVN區(qū)域的TRH水平顯著增加（圖2A）。此外，作者的研究還表明，ART治療導(dǎo)致血清TSH、游離總甲狀腺素（FT4）和游離總?cè)饧谞钕僭彼幔?span>FT3）水平顯著上調(diào)。這些觀察結(jié)果表明，ART可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)來改善HFD誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂（圖2B-2D）。特別地，在LO2細(xì)胞上進(jìn)行了使用l-THY作為合成甲狀腺激素的概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)l-THY顯著抑制PA或OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚。類似地，l-THY減少了PA或OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中的異常脂質(zhì)積聚，表明TH在控制肝臟脂質(zhì)代謝中的重要作用。

        為進(jìn)一步證實(shí)ART介導(dǎo)的TH釋放和脂質(zhì)代謝的相關(guān)性，作者接下來使用噻唑（THI，一種甲狀腺功能抑制劑）治療HFD喂養(yǎng)的小鼠（圖2E）。如圖2F-2H所示，THI顯著逆轉(zhuǎn)了ART調(diào)節(jié)的TC、TG和非HDL-C的下降。此外，THI阻斷了ART介導(dǎo)的對(duì)肝臟脂質(zhì)積聚的抑制（圖2I-2J）。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)THI明顯消融ART降低了Scd1，而ART增加了Cpt1a、Ppara mRNA水平。

        由于甲狀腺激素受體（THRs）是能量消耗和肝臟脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，作者試圖探討ART誘導(dǎo)的TH釋放是否通過TH/THRs途徑改善肝臟脂質(zhì)代謝。在這項(xiàng)研究中，開發(fā)了一種肝特異性腺相關(guān)病毒-5-小分子短病毒蛋白-RNA-TH受體β（Ash-Thrb），可特異性靶向并降低THRβ蛋白的表達(dá)。作為Thrb敲低的結(jié)果，THRβ蛋白表達(dá)被成功降低（圖2K）。數(shù)據(jù)表明，Thrb敲低逆轉(zhuǎn)了注射Ash-Thrb的C57BL/6J小鼠中ART-介導(dǎo)的TC、TG和非HDL-C的下調(diào)（圖2L-2N）。此外，作者的研究結(jié)果表明，在Thrb敲低模型中，ART治療對(duì)肝臟脂質(zhì)積聚沒有表現(xiàn)出顯著的抑制作用（圖2O-2P）。這一觀察結(jié)果表明，TH/THRs信號(hào)通路在ART調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)紊亂中起著至關(guān)重要的作用。此外，作者還利用HepG2細(xì)胞研究了TH介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝的潛在信號(hào)機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞中，l-THY通過阻斷核受體輔壓因子1（NcoR1）和組蛋白脫乙酰酶3（HDAC3）之間的相互作用，顯著降低PA誘導(dǎo)的乙酰組蛋白H3（K9）和乙酰組蛋白H4（K16），HDAC3先前被報(bào)道為肝臟脂質(zhì)代謝的基本生物途徑。此外，Thrb敲低抑制了HepG2細(xì)胞中l-THY改善的Cpt1a和Ppara mRNA水平，表明TH通過THR依賴性的乙酰組蛋白下調(diào)來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，ART可能通過TH/THR級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝（圖2Q）。

圖2：TH介導(dǎo)ART治療C57BL/6J小鼠HFD喂養(yǎng)的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂

3下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥對(duì)TRH神經(jīng)元損傷的神經(jīng)內(nèi)分泌控制作用

        下丘腦TRH神經(jīng)元對(duì)甲狀腺激素水平的中樞調(diào)節(jié)已被廣泛認(rèn)可。由于小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與神經(jīng)炎癥和由此產(chǎn)生的神經(jīng)元損傷高度相關(guān)，作者推測(cè)ART可能通過抑制HFD誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活來保護(hù)下丘腦TRH神經(jīng)元。正如預(yù)期的那樣，作者在HFD喂養(yǎng)的小鼠下丘腦PVN中觀察到高電離鈣結(jié)合適配器分子1（Iba1）的表達(dá)（小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物）（圖3A），表明脂質(zhì)代謝紊亂加速了小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。然而，ART顯著降低Iba1的表達(dá)并改善了小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)（圖3A）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，ART降低了HFD誘導(dǎo)的下丘腦PVN中的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)（腫瘤壞死因子-α、TNF-α和白細(xì)胞介素-6、IL-6）（圖3B-3C）。PVN區(qū)域的免疫熒光分析顯示TNF-α/IL-6與Iba1共定位，表明小膠質(zhì)細(xì)胞主要參與這些炎癥因子的產(chǎn)生。此外，作者發(fā)現(xiàn)ART顯著阻斷PA誘導(dǎo)的BV-2和原發(fā)性小膠質(zhì)細(xì)胞中一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生（圖3D-3F）。

        鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中發(fā)揮著重要作用，作者建立了原代神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停▓D3G）。研究結(jié)果顯示，來源于PA處理小膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM-PA）顯著降低來源于PVN神經(jīng)元的活力，并抑制TRH的表達(dá)。值得注意的是，ART直接治療并沒有減輕這種有害影響。然而，如圖3H-3I所示，CM-PA治療降低神經(jīng)元活力和TRH表達(dá)，而PA/ART聯(lián)合治療的小膠質(zhì)細(xì)胞衍生條件培養(yǎng)基（CM-ART）顯著增加了神經(jīng)元活力。在體內(nèi)，作者對(duì)PVN中的TRH和Iba1進(jìn)行免疫熒光染色。觀察到活化的小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba1陽(yáng)性）周圍的TRH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，ART治療有效改善了這一情況（圖3J）。此外，TRH和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的免疫熒光染色顯示，ART對(duì)TRH和GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物）的共同表達(dá)沒有表現(xiàn)出明顯的影響（圖S6Q）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在下丘腦PVN中ART保護(hù)的TRH神經(jīng)元中起著至關(guān)重要的作用。

圖3：ART保護(hù)PVN區(qū)神經(jīng)元免受神經(jīng)炎癥的影響

4 PKCδ作為細(xì)胞靶點(diǎn)對(duì)抗微膠質(zhì)細(xì)胞活化

        為探索小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥靶蛋白，作者進(jìn)行了熱蛋白質(zhì)組分析（TPP）技術(shù)來鑒定ART的細(xì)胞靶點(diǎn)。然后，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）總共鑒定了2292個(gè)潛在的ART結(jié)合蛋白，根據(jù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性（重/輕，H/L比）和p值確認(rèn)了其中118個(gè)（圖4A）。從最初的候選蛋白庫(kù)中，基于它們對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜的顯著貢獻(xiàn)，共選擇20種潛在的靶蛋白進(jìn)行進(jìn)一步篩選。這一選擇過程涉及利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)與連接性圖分析相結(jié)合。接下來，生物功能注釋揭示了三種主要的炎癥相關(guān)蛋白，包括蛋白激酶Cδ（PKCδ）、Serpinb1a和Serpinb6。特別是，PKC在先前的報(bào)告中強(qiáng)調(diào)了一種有前景的“可藥用性”，暗示ART可能是一種潛在的PKC抑制劑。接下來，用泛PKC抑制劑staurosporine（STAU）進(jìn)行的NO測(cè)定也驗(yàn)證PKC是與神經(jīng)炎癥病理相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖4B）。

        PKC家族成員分為多種亞型，負(fù)責(zé)不同的生物功能。除了PKCδ，還報(bào)道了PKCα、PKCζ和PKCμ與炎癥過程高度相關(guān)。為探索ART與PKCδ的選擇性相互作用，作者合成了生物素標(biāo)記的ART探針（生物素ART）用于下拉分析。如圖4C-4E所示，生物素ART顯著降低了PKCδ，而生物素ART被過量的ART阻斷。然而，ART與其他PKC沒有表現(xiàn)出顯著的相互作用，包括PKCα、PKCζ和PKCμ。此外，作者還發(fā)現(xiàn)ART在細(xì)胞熱位移測(cè)定（CETSA）實(shí)驗(yàn)中顯著阻止PKCδ蛋白的降解，但對(duì)PKCα、PKCζ和PKCμ沒有影響（圖4F）。類似地，藥物親和響應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性（DARTS）分析表明，ART專門靶向PKCδ，以抑制其對(duì)蛋白酶的蛋白水解（圖4G）。

        PKCδ由一個(gè)N端調(diào)控結(jié)構(gòu)域、一個(gè)C端催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)短的“hinge”區(qū)組成。調(diào)控結(jié)構(gòu)域包含C2樣區(qū)和C1區(qū)，催化結(jié)構(gòu)域包含C3區(qū)和C4區(qū)。為研究哪一個(gè)結(jié)構(gòu)域是ART特別靶向的，作者將PKCδ截短為PKCδ1、PKCδ2、PKCΔ3和PKCδ4（圖4H）。下拉分析顯示，ART與獨(dú)特的C1結(jié)構(gòu)域特異性相互作用，但與C2樣、C3或C4結(jié)構(gòu)域無關(guān)（圖4I-4J）。總之，作者的數(shù)據(jù)表明PKCδ是小膠質(zhì)細(xì)胞中ART的重要細(xì)胞靶點(diǎn)。

圖4：在BV-2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)PKCδ作為ART的主要靶點(diǎn)

5 棕櫚?；揎?span>PKCδ對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用

        由于PKCδ激活是神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵先決條件，作者隨后探討了ART對(duì)PKCδ功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。最近的研究表明，蛋白質(zhì)棕櫚酰化在磷酸化調(diào)節(jié)中起著重要作用，PA與半胱氨酸殘基的共價(jià)連接（S-棕櫚?；┦堑鞍踪|(zhì)的廣泛修飾。首先，作者觀察到PA治療顯著增加了小膠質(zhì)細(xì)胞中PKCδ的磷酸化，這被ART逆轉(zhuǎn)（圖5A）。在這里，作者推測(cè)PKCδ磷酸化可能通過其先前的棕櫚酰化而受到潛在調(diào)節(jié)。為此，作者進(jìn)行?；锼亟粨Q分析，并觀察到PA顯著增加了小膠質(zhì)細(xì)胞中PKCδ棕櫚?；?，這被ART逆轉(zhuǎn)（圖5B）。此外，在喂食HFD小鼠的下丘腦中觀察到PKCδ棕櫚?；黠@增加。特別是，發(fā)現(xiàn)下丘腦中的PKCδ棕櫚?；?span>ART治療顯著阻斷。接下來，作者使用2BP，一種蛋白質(zhì)棕櫚?；铚?，來抑制PA誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞中的PKCδ棕櫚?；?。如圖5C所示，2BP幾乎完全消除了ART介導(dǎo)的PKCδ磷酸化抑制。此外，作者觀察到2BP治療顯著逆轉(zhuǎn)了ART介導(dǎo)的NO、TNF-α和IL-6釋放的抑制作用（圖5D-5F），表明PKCδ棕櫚?；谥|(zhì)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥中起著至關(guān)重要的作用。

        為研究PKCδ棕櫚?；姆肿訖C(jī)制，作者進(jìn)行了全局蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并通過HPLC-MS/MS鑒定ZDHHC5是下丘腦中最重要的棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶。然后敲低ZDHHC5，發(fā)現(xiàn)PA誘導(dǎo)的PKCδ棕櫚?；谇玫?span>ZDHHC5的細(xì)胞中顯著減弱。同時(shí)，ART介導(dǎo)的對(duì)PKCδ磷酸化的抑制也被Zdhhc5敲低顯著阻斷（圖5G），表明Zdhhc5依賴的PKCδ棕櫚酰化有助于PKCδ磷酸化。Co-IP實(shí)驗(yàn)還顯示，PKCδ-ZDHHC5相互作用可被ART在藥理學(xué)上抑制（圖5H）。此外，在si-Zdhhc5治療后，ART失去了對(duì)NO、TNF-α和IL-6釋放的抑制作用（圖5I-5K）。因此，這些結(jié)果表明，ZDHHC5依賴性棕櫚酰化在小膠質(zhì)細(xì)胞中高度參與PKCδ的激活（圖5L）。

        接下來作者研究PKCδ依賴性神經(jīng)炎癥信號(hào)通路。KEGG通路分析富集了3種主要的炎癥信號(hào)通路，包括NLRP3、NF-κB和Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活劑（Jak-Stat）。接下來，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以研究ART對(duì)NLRP3炎癥小體途徑的影響。PA增加了NLRP3、胱天蛋白酶1、IL-1β和IL-18的水平，這一水平被ART顯著逆轉(zhuǎn)。此外，PA組κB激酶β磷酸化抑制劑（pIKKβ）、pNF-κB p65和核因子κBα磷酸化抑制物（pIκBα）的表達(dá)顯著增加，這被ART抑制。此外，作者觀察到PA誘導(dǎo)Jak2、Stat5和Stat3磷酸化水平的增加，這被ART治療阻斷。總之，這些數(shù)據(jù)表明，PKCδ通過獨(dú)特的棕櫚?；揎椬鳛樾∧z質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥的脂質(zhì)傳感器。

圖5：ART通過阻斷PKCδ棕櫚?；种?span>PKCδ磷酸化以減輕神經(jīng)炎癥

6藥理學(xué)靶向下丘腦微膠質(zhì)細(xì)胞PKCδ減輕體內(nèi)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂

        首先，作者研究了藥物靶向下丘腦PKCδ是否表現(xiàn)出抗神經(jīng)炎癥作用。通過CRISPR/Cas9建立Prkcd+/-小鼠模型。發(fā)現(xiàn)ART對(duì)HFD喂養(yǎng)的Prkcd+/+小鼠PVN中Iba1的表達(dá)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，這在Prkcd+/-小鼠中顯著逆轉(zhuǎn)。此外，ART阻斷了HFD喂養(yǎng)的Prkcd+/+小鼠PVN中TNF-α和IL-6的釋放，但在Prkcd+/-小鼠中表現(xiàn)出較小的作用。此外，對(duì)ART的血腦屏障（BBB）轉(zhuǎn)運(yùn)的藥代動(dòng)力學(xué)分析顯示，ART可以通過血腦屏障并在下丘腦中積累（S10H）。這些數(shù)據(jù)表明，ART可能通過靶向PKCδ在下丘腦發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用。

        為進(jìn)一步證實(shí)ART是否通過選擇性靶向PVN小膠質(zhì)細(xì)胞中的PKCδ來抑制下丘腦神經(jīng)炎癥，設(shè)計(jì)了一種小膠質(zhì)細(xì)胞特異性腺相關(guān)病毒-5-小分子短發(fā)夾RNA-Prkcd（Ash-Prkcd），用于小鼠PVN的立體定向顱內(nèi)注射（圖6A-6B）。Ash-Prkcd注射液的給藥有效降低了位于PVN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞中PKCδ的表達(dá)。同樣，作者還發(fā)現(xiàn)，在Ash陰性對(duì)照（Ash-NC）注射組中，ART有效降低了HFD誘導(dǎo)的Iba1產(chǎn)生，而在Ash-Prkcd注射組中ART對(duì)其沒有明顯影響（圖6C）。此外，ART顯著降低Ash NC注射組的下丘腦炎癥介質(zhì)，包括TNF-α和IL-6，這在Ash Prkcd注射小鼠中得到了有效逆轉(zhuǎn)（圖6D-6E）?？傊@些數(shù)據(jù)表明，ART在體內(nèi)選擇性靶向下丘腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞PKCδ，以抑制神經(jīng)炎癥。

        然后，作者試圖測(cè)試藥物靶向PKCδ是否具有降脂作用。如圖6F-6I所示，ART顯著增加NC注射PVN中TRH神經(jīng)元數(shù)量，從而促進(jìn)甲狀腺激素的產(chǎn)生。然而，在注射Ash-Prkcd的小鼠中沒有觀察到類似的效果。此外，在注射Ash-NC的小鼠中，ART顯著改善了HFD誘導(dǎo)的TC、TG和非HDL-C水平，而在注射Ash-Prkcd的小鼠中ART治療沒有顯示出類似的治療效果（圖6J-6L）。同時(shí)，ART改善了注射Ash-NC的HFD誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變性和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)；然而，Ash-Prkcd注射逆轉(zhuǎn)了ART依賴性治療效果（圖6M-6O）。此外，ART降低了注射Ash NC小鼠的ALT和AST水平，這在注射Ash Prkcd小鼠中也被消融（圖6P-6Q）。為了排除PKCδ對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的直接影響，作者下調(diào)了HepG2和LO2細(xì)胞中PKCδ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ART對(duì)脂質(zhì)積累沒有明顯的調(diào)節(jié)作用?？傊?，作者的研究結(jié)果表明，下丘腦中小膠質(zhì)細(xì)胞PKCδ是緩解體內(nèi)肝臟脂質(zhì)紊亂的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖6：Prkcd敲低PVN區(qū)逆轉(zhuǎn)ART對(duì)C57BL/6J小鼠HFD喂養(yǎng)的肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的抑制作用

7 PKCδ與高脂血癥患者腦內(nèi)微膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)

        作者從5名對(duì)照捐贈(zèng)者和5名高脂血癥患者那里獲得了腦組織和血清樣本（圖7A）。免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，高脂血癥患者大腦中的PKCδ、pPKCδ和plam PKCδ水平均較高（圖7B-7C）。此外，免疫熒光分析顯示，在高脂血癥的大腦中，pPKCδ與Iba1的共定位顯著增加。這一發(fā)現(xiàn)表明PKCδ激活和小膠質(zhì)細(xì)胞激活之間存在正相關(guān)（圖3D）。同時(shí)，作者證實(shí)了高脂血癥大腦中TRH水平的降低（圖7E）。重要的是，作者還觀察到一種趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因?yàn)楦咧Y患者的TC、TG和LDL-C水平與Iba1和plam PKCδ表達(dá)呈正相關(guān)的個(gè)體間變異性很高，而且受試者數(shù)量有限（圖7F）。此外，TRH水平與高脂血癥的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)（圖7F）?？傊@些數(shù)據(jù)表明PKCδ介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥可能與脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。

        接下來，作者進(jìn)行了單核RNA-seq，以表征腦組織中的細(xì)胞類型。在對(duì)照組和患者之間，小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞簇的UMAP圖和細(xì)胞百分比發(fā)生了顯著變化。這些數(shù)據(jù)顯示，高脂血癥腦小膠質(zhì)細(xì)胞中PKCδ相關(guān)炎癥信號(hào)持續(xù)增加，如Toll樣受體、NF-κB、絲裂原活化激酶樣蛋白（MAPK）、NOD樣受體和JAK-STAT通路（圖7G）。在神經(jīng)元中，KEGG通路分析表明，幾種常見的神經(jīng)元存活通路被下調(diào)，這些通路與谷氨酸能、膽堿能、GABA能和多巴胺能突觸功能高度相關(guān)。此外，一些神經(jīng)元凋亡途徑，如活性氧信號(hào)級(jí)聯(lián)也被上調(diào)。

        為進(jìn)一步對(duì)TRH神經(jīng)元進(jìn)行詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，作者在神經(jīng)元群體中進(jìn)行了無偏聚類。結(jié)果顯示了8個(gè)神經(jīng)元簇（圖7H）。在這些簇中，神經(jīng)元SAI高表達(dá)TRH基因，高脂血癥腦中的細(xì)胞百分比顯著降低（圖7I-7J）。對(duì)神經(jīng)元SAI的進(jìn)一步KEGG分析顯示，TH合成減少，TH信號(hào)通路下調(diào)，這表明PKCδ介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活可能特別導(dǎo)致高脂血癥腦中TRH神經(jīng)元損傷（圖7K）。總之，這些數(shù)據(jù)表明大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞PKCδ激活與外周脂質(zhì)代謝紊亂的臨床關(guān)聯(lián)。

圖7：PKCδ表達(dá)在脂肪腦中上調(diào)并與高脂血癥進(jìn)展相關(guān)

結(jié)論：

        總之，作者提供了概念證據(jù)，證明下丘腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞PKCδ通過神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂。特別是，這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向小膠質(zhì)細(xì)胞PKCδ可能是治療脂肪肝的一種有前途的治療方法，這與目前的治療策略不同。

實(shí)驗(yàn)方法：

        細(xì)胞培養(yǎng)，油紅O染色，血清生化分析，免疫組化，RT-PCR，尼羅紅染色，免疫熒光，細(xì)胞活力分析，熱蛋白質(zhì)組分析（TPP），單細(xì)胞測(cè)序，Pull-down，細(xì)胞熱位移測(cè)定（CETSA），Co-IP，siRNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，WB，UPLC-MS/MS

參考文獻(xiàn)：

        Wang YH, Chen X, Bai YZ, Gao P, Yang Z, Guo Q, Lu YY, Zheng J, Liu D, Yang J, Tu PF, Zeng KW. Palmitoylation of PKCδ by ZDHHC5 in hypothalamic microglia presents as a therapeutic target for fatty liver disease. Theranostics 2024; 14(3):988-1009. doi:10.7150/thno.89602. https://www.thno.org/v14p0988.htm