在肝細胞癌(HCC)中,功能增強(GOF)CTNNB1突變(CTNNB1GOF)引起明顯的免疫逃逸,并對抗PD-1產(chǎn)生抗藥性。在這里,我們的目標是調(diào)查CTNNB1GOF HCC介導的免疫逃逸機制,并提出一種新的治療策略,以增強在HCC中抗PD-1的療效。進行RNA測序以識別與免疫逃逸相關的CTNNB1GOF的關鍵下游基因。利用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)、小鼠皮下或正位模型、在條件基因敲除小鼠中的自發(fā)性腫瘤模型以及流式細胞術,探索基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)在腫瘤進展和免疫逃逸中的生物學功能。利用單細胞RNA測序和蛋白質(zhì)組學來深入了解MMP9的潛在機制。在CTNNB1GOF HCC中,MMP9顯著上調(diào)。MMP9抑制了CD8+ T細胞的浸潤和細胞毒性,這對于CTNNB1GOF引發(fā)抑制性腫瘤免疫微環(huán)境(TIME)和抗PD-1抗性至關重要。從機制上講,CTNNB1GOF下調(diào)了sirtuin 2(SIRT2),導致促進β-連環(huán)蛋白/賴氨酸去甲基酶4D(KDM4D)復合物形成,促進MMP9的轉(zhuǎn)錄激活。HCC分泌的MMP9介導了CD8+ T細胞中slingshot蛋白磷酸酶1(SSH1)的脫落,導致抑制C-X-C motif趨化因子受體3(CXCR3)介導的G蛋白偶聯(lián)受體內(nèi)的信號傳導。此外,MMP9阻斷重塑了TIME,并增強了在HCC中抗PD-1療法的敏感性。CTNNB1GOF通過激活MMP9的分泌引起抑制性TIME。針對MMP9重塑TIME并增強CTNNB1GOF HCC中抗PD-1的療效。
該研究于2023年12月發(fā)表在《Gut》,IF:24.5。
技術路線:
結(jié)果:
1、MMP9 在 CTNNB1GOF HCC 中表達上調(diào)
為了識別由CTNNB1GOF驅(qū)動的激活基因,我們通過流體動力學尾靜脈注射(HTVi)激活的AKT/β-連環(huán)蛋白、c-Met/β-連環(huán)蛋白和c-Myc/β-連環(huán)蛋白的三種HCC模型構(gòu)建了具有CTNNB1GOF背景的三種類型。ΔN90-β-連環(huán)蛋白質(zhì)通過HTVi與另一個致癌基因質(zhì)結(jié)合,促使肝臟中的腫瘤發(fā)生。然后,使用流式細胞儀(FCM)和t-分布式隨機鄰域嵌入(t-SNE)分析對肝臟免疫微環(huán)境進行了分析。與先前的報告一致,在CTNNB1GOF HCC中,巨噬細胞和骨髓源性抑制性細胞的浸潤增加,而DCs、CD8+和CD4+ T細胞減少(圖1A–C)。與此同時,CD8+ Granzyme B+ T細胞減少,表明CTLs的細胞毒性受損。由于腫瘤負擔較高,實驗組的總生存期(OS)縮短。隨后,對三對模型進行了RNA-seq。韋恩圖顯示了3個上調(diào)基因(MMP9、PROCR、ZFP287)的重疊(折疊變化(FC)>1.0,p<0.05)(圖1D)。為了識別與免疫調(diào)節(jié)和不良預后相關的核心基因,我們通過在癌癥基因組學數(shù)據(jù)庫(TCGA)數(shù)據(jù)集中使用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(PPI網(wǎng)絡)和單變量COX回歸對ImmuneScore和StromalScore篩選的差異表達基因(DEGs)進行了分析。結(jié)果,確定了五個基因(CXCL5、MMP9、PLAUR、CLEC5A、ITGB6)(圖1E)。這兩個基因集的交集確定MMP9是潛在的CTNNB1GOF驅(qū)動基因,可能在HCC中重塑TIME。然后,驗證了MMP9在CTNNB1GOF腫瘤中高表達(圖1F)。
MMP9在多個基因表達均衡數(shù)據(jù)庫中都被證實在HCC中上調(diào)。此外,根據(jù)Lu的單細胞測序數(shù)據(jù),肝細胞中MMP9在HCC進展過程中呈最顯著升高(圖1G)。此外,我們使用國際癌癥基因組學聯(lián)盟數(shù)據(jù)集中的21基因特征調(diào)查了CTNNB1的活化狀態(tài)。結(jié)果顯示,在CTNNB1突變的活躍狀態(tài)下,MMP9上調(diào)(圖1H)。MMP9在CTNNB1GOF HCC中的上調(diào)也在同濟隊列中觀察到(圖1I和J)。與此同時,CTNNB1GOFMMP9高表達的腫瘤與更差的生存和較低的無病生存率相關(圖1K)。這些結(jié)果表明MMP9在CTNNB1GOF HCC中上調(diào),并與不良預后相關。
2、MMP9通過誘導抑制性的免疫微環(huán)境(TIME)促進HCC的進展
基因集富集分析(GSEA)顯示MMP9表達與TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中的抑制性免疫微環(huán)境(TIME)相關。MMP9在體外和BALB/c裸鼠的腫瘤增殖中幾乎沒有影響(圖2A)。然而,MMP9的敲低顯著減少了C57BL/6 J小鼠的腫瘤體積和重量(圖2B)。對兩組小鼠脾臟的流式細胞儀(FCM)分析確認,盡管T淋巴細胞的比例相近,但在BALB/c裸鼠中成熟的CD4+和CD8+ T細胞幾乎不存在。
接下來,使用MMP9敲低處理的Hepa1-6細胞構(gòu)建了原位HCC模型,結(jié)果顯示明顯抑制了腫瘤形成并改善了生存(圖2C–E)。FCM分析顯示MMP9敲低組中總T淋巴細胞、CD8+和CD4+ T細胞增加,而巨噬細胞減少(圖2F和G)。同時,CD8+ T細胞中Granzyme B和干擾素γ(IFN-γ)的增加表明CTLs的細胞毒性增強(圖2H)。免疫組化(IHC)和多重免疫熒光(mIF)分析進一步證實了這些結(jié)果。盡管巨噬細胞的總數(shù)減少,但M2表型向M1表型的轉(zhuǎn)變得以觀察(圖2I)。隨后的分析顯示CD8+ T細胞中PD-1和T細胞免疫球蛋白和黏液結(jié)合域-3(TIM-3)減少(圖2J)。此外,使用CD44和CD62L標記CD8+和CD4+ T細胞的結(jié)果表明,在MMP9敲低后,免疫記憶反應水平提高(圖2J)??偟膩碚f,這些發(fā)現(xiàn)表明MMP9通過誘導抑制性的TIME促進了HCC的進展。
3、MMP9 抑制 CD8+ T 細胞的激活和遷移
考慮到在MMP9下調(diào)后T淋巴細胞和巨噬細胞極化均發(fā)生了變化,我們通過消除CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或巨噬細胞來進一步確定MMP9調(diào)控的特定免疫細胞亞群。分別使用抗CD4中和抗CD8中和抗補體進行原位HCC模型處理(圖3A)。通過FCM監(jiān)測清道夫的效果(圖3B)。CD8+ T細胞的消耗剝奪了MMP9下調(diào)的抑制腫瘤效果,導致更重的腫瘤負擔和縮短的生存期(圖3C–E)。相反,CD4+ T細胞和巨噬細胞的消耗無法恢復腫瘤生長。這些結(jié)果確認了抑制CD8+ T細胞對于MMP9促進腫瘤進展至關重要。
為了揭示MMP9對CD8+ T細胞激活的影響,進行了體外共培養(yǎng)研究。小鼠脾臟CD8+ T細胞受到重組MMP9蛋白的刺激,并與Hepa1-6細胞共培養(yǎng)24小時(圖3F)。CD8+ T細胞的腫瘤毒性在MMP9刺激下呈劑量依賴性減弱(圖3G)。CD8+ T細胞在MMP9刺激下的細胞培養(yǎng)上清Elisa測定顯示,MMP9抑制了肌酸酶B、干擾素γ和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的分泌(圖3H)。為了描繪MMP9在CD8+ T細胞遷移中的作用,將腫瘤條件培養(yǎng)基(CM)添加到下層培養(yǎng)皿,并評估CD8+ T細胞向下層培養(yǎng)皿的遷移(圖3I)。結(jié)果表明MMP9抑制了CD8+ T細胞的趨化作用(圖3I)。此外,MMP9不影響CD8+ T細胞的增殖(圖3J)??偟膩碚f,這些觀察結(jié)果表明MMP9阻礙了CD8+ T細胞的激活和遷移,導致了抑制性的免疫微環(huán)境。
4、MMP9 阻斷可改善 CTNNB1GOF HCC 中的 TIME 并增強抗 PD-1 功效
基于抗PD-1的免疫療法已廣泛用于HCC治療,并且已報道腫瘤浸潤的CD8+ T細胞是抗PD-1療法的生物標志物。鑒于MMP9對CD8+ T細胞的影響,我們推測MMP9的阻斷可能增強抗PD-1療法的療效。
為了評估MMP9阻斷對CTNNB1GOF HCC中抗PD-1療效的影響,我們在MMP9肝細胞條件敲除小鼠(MMP9F/F; MMP9-Alb-cre,以下簡稱MMP9Δhep)中構(gòu)建了CTNNB1GOF自發(fā)性腫瘤模型。在腫瘤形成后,一部分小鼠接受了抗PD-1抗體治療(圖4A)。通過肝形態(tài)學、H&E染色和免疫組織化學(IHC)的驗證,所有小鼠均被確定為攜帶CTNNB1GOF的HCC模型(圖4B)。值得注意的是,與其他組相比,接受抗PD-1抗體治療的MMP9Δhep小鼠顯示出顯著的腫瘤抑制和生存延長(圖4C,F)。流式細胞儀分析顯示,與其他組相比,接受抗PD-1治療的MMP9Δhep小鼠CD8+細胞顯著增加(圖4D)。CD8+ T細胞中Granzyme B和IFN-γ的增加表明CTLs的細胞毒性增強(圖4E)。此外,聯(lián)合治療組的多器官未觀察到病變,表明MMP9阻斷和抗PD1的聯(lián)合治療總體上是安全的。血常規(guī)和血生化分析顯示,聯(lián)合治療有效緩解了腫瘤負擔引起的肝臟和腎臟損傷。
我們進一步引入了MMP-9-in-1,一種特異的MMP9抑制劑,選擇性靶向血漿蛋白飽和度(PEX)。類似地,MMP-9-in-1與抗PD-1聯(lián)合治療CTNNB1GOF HCC模型(圖4G)。一致地,與MMP-9-in-1或抗PD-1單獨治療相比,聯(lián)合治療導致更為顯著的腫瘤回歸和生存延長(圖4H1和L)。流式細胞儀分析顯示,聯(lián)合治療增強了CD8+ T細胞的浸潤和細胞毒性(圖4J和K)。聯(lián)合治療的安全性也通過相同的方式得到驗證。
這些結(jié)果表明,MMP9阻斷有潛力重塑CTNNB1GOF HCC的免疫微環(huán)境,并增強對抗PD-1治療的敏感性。
5、β-連環(huán)蛋白介導的 SIRT2 抑制通過促進 β-連環(huán)蛋白/KDM4D 復合物的形成上調(diào) MMP9
我們進一步研究了β-catenin調(diào)控MMP9的精確機制。在組裝轉(zhuǎn)錄復合物之前,β-catenin與各種蛋白相互作用形成不同的蛋白復合物,執(zhí)行不同的功能。據(jù)報道,KDM4D與β-catenin相互作用,導致MMP9啟動子上H3K9me3的去甲基化。SIRT2可以直接與β-catenin相互作用,抑制Wnt信號輸出,而抑制Wnt/β-catenin信號增強SIRT2啟動子活性。我們發(fā)現(xiàn)XAV939通過激活Wnt/β-catenin信號途徑促進了KDM4D的表達,并以劑量依賴和時間依賴的方式抑制了SIRT2的表達(圖5A,B)。共免疫沉淀(CoIP)結(jié)果驗證了β-catenin與KDM4D或SIRT2的結(jié)合(圖5C,D)。免疫熒光證實了在Hepa1-6細胞的細胞質(zhì)和細胞核中β-catenin與KDM4D或SIRT2的共定位(圖5E)。
基于以上觀察,我們假設SIRT2和KDM4D可能與β-catenin競爭結(jié)合。CoIP結(jié)果表明,SIRT2的過表達顯著抑制了β-catenin與KDM4D的結(jié)合(圖5F,G)。此外,在KDM4D過表達的Hepa1-6細胞中,SIRT2的過表達限制了MMP9的上調(diào)(圖5H)。隨后,通過KDM4D敲除或SIRT2過表達誘導的MMP9蛋白的下調(diào)在laduviglusib的刺激下被逆轉(zhuǎn)(圖5I,J)。此外,KDM4D敲除或SIRT2過表達抑制了MMP9的表達,并導致TIME的激活,從而抑制了腫瘤的形成(圖5K–M)。這些結(jié)果表明,通過β-catenin抑制SIRT2促進了β-catenin/KDM4D復合物的形成,從而通過上調(diào)MMP9促使抑制性TIME的形成。
6、MMP9 抑制 CTNNB1GOF HCC 中 CD8+ CXCR3+ T 細胞的浸潤
接下來,我們進行了scRNA-seq以探討MMP9在重塑TIME方面的機制。利用熒光激活細胞分選(FACS)從MMP9F/F和MMP9Δhep小鼠的CTNNB1GOF HCC組織中分離腫瘤CD45+細胞。對總CD45+細胞群體的無監(jiān)督統(tǒng)一流形逼近和投影(UMAP)分析確定了23個亞群(圖6A)。所確定的免疫細胞群體包括T細胞、髓樣細胞、NK細胞、B細胞、DCs和中性粒細胞。所有細胞都表達高水平的家庭基因ACTB,而免疫細胞是PTPRC+,AFP,表明我們的數(shù)據(jù)的準確性。這些細胞亞型在MMP9F/F和MMP9Δhep小鼠中是共享的(圖6A)。鑒于髓樣細胞的大比例,我們進行了單獨的分析以確定髓樣和非髓樣細胞的比例(圖6B)。
在先前建立了MMP9在促進CD8+ T細胞依賴性HCC中的作用后,我們對CD8+ T細胞進行了無監(jiān)督聚類分析。結(jié)果揭示了六個不同的CD8+ T細胞亞型,即CD8 MKI67、CD8 CCR7、CD8 GZMM、CD8 CXCR3、CD8 PDCD1和CD8 ITGA4(圖6C)。特別是,MMP9Δhep樣本顯示了CD8 CXCR3細胞的最顯著增加(圖6D)。我們觀察到CD8 CXCR3細胞的轉(zhuǎn)錄譜與已報道的與效應T細胞功能相關的CD8 CX3CR1細胞一致。隨后,我們研究了CD8+ T細胞的動態(tài)免疫狀態(tài)。偽時間分析顯示,過渡過程始于CD8 CCR7細胞,通過以CD8 GZMM和CD8 CXCR3細胞為特征的中間細胞毒狀態(tài),最終導致以CD8 PDCD1和CD8 ITGA4細胞為特征的增殖(CD8 MKI67細胞)或衰竭(圖6E)。為了進一步描繪過渡狀態(tài),我們分別分析了來自MMP9F/F和MMP9Δhep樣本的CD8+ T細胞的軌跡。令人驚訝的是,CD8 CXCR3細胞主要分布在MMP9Δhep樣本中(圖6F,G)。因此,我們得出結(jié)論,MMP9敲除主要影響CD8+ CXCR3+ T細胞的浸潤和功能。這一結(jié)果得到了mIF染色實驗的進一步支持,確認了MMP9Δhep樣本中CD8+CXCR3+ T細胞的富集(圖6H)。基因本體論(GO)和基因組的京都百科全書(KEGG)通路富集分析表明,CD8+CXCR3+ T細胞特異地富集于G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體活性、調(diào)節(jié)T細胞激活、白細胞遷移和細胞黏附等方面(圖6I)。
7、MMP9 通過蛋白水解 SSH1 從 CD8+ T 細胞中脫落抑制 CXCR3 介導的 GPCR 細胞內(nèi)信號傳導
我們假設MMP9介導了對CD8+ T細胞表面蛋白的裂解,從而抑制了GPCR介導的CXCR3內(nèi)部信號傳導。蛋白質(zhì)組學鑒定了在MMP9刺激后CD8+ T細胞中下調(diào)的26種蛋白質(zhì)(圖7A),這些蛋白質(zhì)富集于GTP酶活性、GDP磷酸酶活性、調(diào)節(jié)細胞質(zhì)鈣離子濃度和細胞遷移等過程(圖7B)。GSEA進一步證明MMP9刺激與多種膜轉(zhuǎn)運過程相關聯(lián)(圖7C)。同樣,MMP9抑制了CD8+ T細胞中CXCR3介導的ERK和AKT的磷酸化(圖7D)。與未受MMP9刺激的T細胞相比,受MMP9刺激的CD8+ T細胞的F-actin分散在細胞外緣,而在T細胞的前緣積聚(圖7E)。這些數(shù)據(jù)表明MMP9抑制了GPCR的CXCR3介導的內(nèi)部信號傳導。此外,在MMP9刺激下,促進定向細胞遷移和T細胞對抗原刺激的SSH1在CD8+ T細胞中顯著降低(圖7A,D)。 MMP9和SSH1之間觀察到的負相關提示了MMP9在SSH1裂解中的潛在作用。
進一步研究了SSH1在CD8+ T細胞中的作用。CoIP和免疫熒光染色表明SSH1可以與CXCR3結(jié)合,但在MMP9介導的SSH1裂解時解離(圖7F,G)。在CXCL10刺激下,CD8+ T細胞中SSH1的敲除抑制了ERK和AKT的磷酸化刺激(圖7H),并阻礙了CD8+ T細胞的激活、遷移和極化(圖7I–L)。此外,SSH1的上調(diào)消除了MMP9誘導的CD8+ T細胞遷移和激活的抑制作用??傮w而言,這些發(fā)現(xiàn)表明MMP9通過裂解CD8+ T細胞表面的SSH1來阻礙GPCR的CXCR3介導的內(nèi)部信號傳導。
8、MMP9 為 HCC 免疫治療提供了有價值的治療靶點和生物標志物
這些研究啟發(fā)我們提出通過靶向MMP9來開發(fā)新的治療方法。開發(fā)了一種新的抗MMP9兔單克隆抗體(mAb),并評估了其在臨床實踐中的潛在治療價值。無論是抗PD-1還是抗MMP9單藥療法都在一定程度上抑制了腫瘤生長(圖8A),而聯(lián)合治療則更顯著地抑制了腫瘤生長并延長了生存(圖8A和B)。流式細胞儀分析顯示聯(lián)合治療增強了CD8+ T細胞的浸潤和細胞毒性(圖8C)。此外,在治療組中沒有觀察到明顯的毒性,確保了抗MMP9 mAb的安全性??偟膩碚f,這些結(jié)果顯示了抗MMP9 mAb的治療價值,抗MMP9和抗PD-1的聯(lián)合可能是HCC免疫治療的有前景的策略。
在臨床上,我們通過肝切除術或活檢從同濟醫(yī)院收集了原發(fā)性HCC標本進行進一步的分析。在接受術后抗PD-1輔助治療的隊列中(n=38),免疫組化染色結(jié)果顯示,MMP9表達與β-連環(huán)蛋白和KDM4D呈正相關,而與SIRT2呈負相關(圖8D)。tSNE分析顯示,MMP9水平較高的患者腫瘤內(nèi)CD8+CXCR3+T細胞浸潤減少,CD8+T細胞細胞毒性減弱(圖8E)。此外,MMP9表達水平較高的患者術后復發(fā)的可能性較大,與MMP9水平較低的患者相比(圖8F)。類似地,對于接受抗PD-1新輔助治療的患者(n=40),MMP9水平較高導致抑制性TIME和對抗PD-1治療的響應率較低(圖8G–K)。
實驗方法:
流式細胞術、tSNE、RNA-seq、scRNA-seq、免疫印跡、免疫共沉淀、RT-PCR、雙熒光素酶報告測定、免疫組織化學、多重免疫熒光染色、構(gòu)建質(zhì)粒、慢病毒轉(zhuǎn)導、細胞毒性測定、Transwell、F-肌動蛋白染色、串聯(lián)質(zhì)量標簽 (TMT) 標記的蛋白質(zhì)組學。
參考文獻:
Cai N, Cheng K, Ma Y, et al. Targeting MMP9 in CTNNB1 mutant hepatocellular carcinoma restores CD8+ T cell-mediated antitumour immunity and improves anti-PD-1 efficacy. Gut.