蛋白激酶C δ調(diào)節(jié)單核吞噬細(xì)胞并阻礙對(duì)癌癥免疫治療的反應(yīng)

         單核吞噬細(xì)胞（MPs）在維持組織穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，然而MPs也促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和抵抗免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）。靶向MPs可能是提高ICB療效的有效策略。作者報(bào)道了蛋白激酶Cδ （PKCδ），一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在人類(lèi)和小鼠腫瘤的MPs中大量表達(dá)。與野生型小鼠相比，PKCδ?/?小鼠的腫瘤進(jìn)展減少，對(duì)抗PD -1的應(yīng)答增加。來(lái)自PKCδ?/?小鼠的腫瘤表現(xiàn)出TH1傾斜的免疫反應(yīng)，包括抗原呈遞和T細(xì)胞活化增加。體內(nèi)去除MPs改變了對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)，但對(duì)PKCδ - / -小鼠無(wú)影響。與PKCδ+/+對(duì)照相比，在野生型小鼠中同時(shí)注射PKCδ?/? M2樣巨噬細(xì)胞和癌細(xì)胞顯著延遲腫瘤生長(zhǎng)，并顯著增加瘤內(nèi)T細(xì)胞活化。PKCδ缺陷通過(guò)激活I型和II型干擾素信號(hào)重編程MPs。因此，PKCδ可能靶向重編程MPs以增強(qiáng)ICB的功效。文章于2023年12月發(fā)表于《Science advances》，IF：13.6；Q1。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、PKCδ促進(jìn)小鼠腫瘤生長(zhǎng)和免疫抑制

         為了探討蛋白激酶C δ在腫瘤發(fā)生中的作用，作者將乳腺癌（E0771），肺癌（LLC）和黑色素瘤（B16F10）同系小鼠癌細(xì)胞系移植到Prkcd+/+和Prkcd?/?小鼠中。與Prkcd+/+小鼠相比，Prkcd?/?小鼠在E0771和LLC模型中表現(xiàn)出腫瘤生長(zhǎng)的顯著延遲（圖1A和B），但這一效應(yīng)在B16F10模型中不顯著（圖1C）。當(dāng)作者使用流式細(xì)胞術(shù)分析這些腫瘤的瘤內(nèi)免疫細(xì)胞含量時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)在C57BL/6J小鼠中，E0771和LLC腫瘤大量被MPs浸潤(rùn)（分別占所有存活細(xì)胞的27.85%和35.79%），但B16F10腫瘤沒(méi)有（1.59%）（圖1D），這與之前發(fā)表的研究結(jié)果一致。在含有較少MPs的B16F10模型中，這種效應(yīng)的降低表明，PKCδ可能主要調(diào)節(jié)腫瘤中的MPs。

         接下來(lái)，作者通過(guò)大量RNA-seq和差異表達(dá)基因（DEGs）分析，研究了PKCδ缺乏對(duì)E0771腫瘤基因調(diào)控的影響。GO分析Prkcd?/?中上調(diào)的基因揭示了增強(qiáng)的免疫刺激反應(yīng)（如T細(xì)胞活化、IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)和抗原呈遞）（圖1E）。此外，與Prkcd+/+腫瘤相比，參與抗原呈遞、固有免疫和T細(xì)胞活化的基因在Prkcd - / -腫瘤中升高（圖1F）。

         流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與Prkcd+/+ E0771荷瘤小鼠相比，在Prkcd - / -腫瘤（圖1,G和H）和脾臟（圖1,G和I）的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞/iMCs （Ly6Chi細(xì)胞）中，MHCII類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體（MHCII）的表達(dá)增強(qiáng)，這提示這些細(xì)胞的成熟和抗原提呈能力增強(qiáng)。作者還觀察到，與Prkcd+/+腫瘤相比，E0771 Prkcd - / -腫瘤中T細(xì)胞含量（總CD3+ T細(xì)胞以及CD4+和CD8+ T細(xì)胞）的絕對(duì)數(shù)量和頻率顯著增加（圖1,J和K）。在E0771 Prkcd?/?腫瘤中，CD8+ T細(xì)胞活化（IFN-γ+ TNFα+）顯著增加（圖1L）。在Prkcd?/?LLC腫瘤中，與Prkcd+/+腫瘤相比，CD8+ T細(xì)胞含量（圖1M）和PD-1+ CD8+ T細(xì)胞（圖1N）顯著升高。綜上所述，這些結(jié)果表明，PKCδ缺陷限制了MPs高度浸潤(rùn)的腫瘤的生長(zhǎng)，這表明這種抑制可能與浸潤(rùn)MPs改變有關(guān)，而浸潤(rùn)MPs可能影響T細(xì)胞反應(yīng)。

圖1 PKCδ促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和免疫抑制

2、PKCδ在MPs中大量表達(dá)

         因?yàn)樵?span>Prkcd - / -小鼠中，腫瘤消退需要免疫應(yīng)答，因此作者詢問(wèn)哪些細(xì)胞不僅在腫瘤中，而且在穩(wěn)定狀態(tài)下在器官中表達(dá)高水平的PKCδ。首先，作者利用公開(kāi)數(shù)據(jù)集的scRNA-seq分析研究了幾種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞水平上PKCδ的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)，在人三陰性乳腺癌（TNBC）（圖2, A和B）和黑色素瘤（圖2, C和D）中，相對(duì)于其他免疫浸潤(rùn)細(xì)胞，大量MPs大量表達(dá)PRKCD （PKCδ基因）。

         接下來(lái)，作者使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了PKCδ蛋白在E0771荷瘤小鼠脾臟和腫瘤細(xì)胞群中的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)PKCδ在E0771腫瘤（圖2E）中主要由MPs表達(dá)。此外，與脾臟相比，來(lái)自E0771荷瘤小鼠的MPs在腫瘤中具有顯著更高的PKCδ表達(dá)（圖2F、G）。值得注意的是，來(lái)自腫瘤的骨髓細(xì)胞比來(lái)自脾臟的骨髓細(xì)胞更具有免疫抑制作用。PKCδ在T細(xì)胞和NK細(xì)胞中也中度上調(diào)，但在Ly6G+細(xì)胞中沒(méi)有上調(diào)（圖2G）。因此，PKCδ表達(dá)與更多的免疫抑制MPs相關(guān)，這暗示了在MPs中促進(jìn)免疫抑制的潛在作用。接下來(lái)，作者檢查了PKCδ在M2樣（可選激活）極化骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDMs）中的表達(dá)，已知其具有免疫抑制和腫瘤促進(jìn)作用。正如預(yù)期的那樣，M2樣BMDMs表達(dá)較低水平的M1標(biāo)記CD86和較高水平的M2標(biāo)記CD206。作者還發(fā)現(xiàn)，與非極化BMDMs相比，PKCδ在M2樣BMDMs中的表達(dá)明顯更高（圖2,H和I）?？傊@些發(fā)現(xiàn)表明PKCδ可能是MP調(diào)節(jié)或免疫抑制狀態(tài)的關(guān)鍵控制器。

圖2 PKCδ在癌癥中由MPs大量表達(dá)

3、PKCδ缺乏通過(guò)MPs損害腫瘤生長(zhǎng)和免疫抑制

         為了研究腫瘤抑制和T細(xì)胞活化是否需要MPs中的PKCδ缺乏，作者首先使用抗ly6c單克隆抗體和氯膦酸脂質(zhì)體聯(lián)合去除Prkcd+/+和Prkcd - / - E0771荷瘤小鼠中的MPs（圖3A）。根據(jù)之前的報(bào)道，作者觀察到MP消耗顯著延遲了野生型小鼠（Prkcd+/+）的腫瘤生長(zhǎng)（圖3B和D）。相比之下，在Prkcd?/?小鼠中，MP的消耗并沒(méi)有延遲腫瘤的生長(zhǎng)，而是促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，其程度與Prkcd+/+小鼠相當(dāng)（圖3C和D）。這些結(jié)果表明，PKCδ缺陷可能將MPs從原腫瘤表型重編程為抗腫瘤表型。

         接下來(lái)，作者研究了M2樣BMDMs中的PKCδ缺乏是否會(huì)降低其促進(jìn)腫瘤和T細(xì)胞抑制活性（圖3E）。與共注射Prkcd+/+ M2樣BMDMs的癌細(xì)胞（LLC）相比，共注射Prkcd?/?M2樣BMDMs的癌細(xì)胞（LLC）的腫瘤生長(zhǎng)顯著延遲（圖3F）。作者觀察到，與Prkcd+/+ M2樣BMDMs + LLC腫瘤相比，Prkcd - / - M2樣BMDMs + LLC腫瘤中CD8+（圖3G和H）和CD4+（圖3G至I） T細(xì)胞的活化（IFN-γ+ TNFα+）顯著增加。Prkcd?/?M2樣BMDMs與LLC細(xì)胞共注射導(dǎo)致了腫瘤生長(zhǎng)的延長(zhǎng)延遲，這可能歸因于BMDMs與TME中其他細(xì)胞之間關(guān)鍵的早期相互作用。過(guò)繼轉(zhuǎn)移的BMDMs可能隨著時(shí)間的推移被宿主腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）稀釋?zhuān)@可能導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞表型的早期轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展延遲但不能完全控制?？傊?，作者的研究結(jié)果表明PKCδ在控制MP誘導(dǎo)的效應(yīng)T細(xì)胞抑制和隨后的腫瘤促進(jìn)中起關(guān)鍵作用。

圖3 PKCδ的缺失通過(guò)MPs損害腫瘤生長(zhǎng)和免疫抑制

4、PKCδ缺乏增強(qiáng)MPs的抗原呈遞和交叉呈遞能力

         抗原呈遞到CD4+ T細(xì)胞和抗原交叉呈遞到CD8+ T細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞（APCs）發(fā)起有效抗腫瘤免疫應(yīng)答的標(biāo)志性特性。作者用OVA對(duì)分離自Prkcd+/+和Prkcd?/?小鼠的BMDMs和DCs進(jìn)行脈沖處理，然后與H-2Kb-OVA肽特異性T細(xì)胞受體（TCR）轉(zhuǎn)基因OT-I CD8+ T細(xì)胞或OT-II CD4+ T細(xì)胞孵育，并通過(guò)分析細(xì)胞微量紫（CTV）增殖染料的稀釋度來(lái)測(cè)定T細(xì)胞增殖。作者發(fā)現(xiàn)，與Prkcd+/+ BMDMs和DCs相比，Prkcd?/?BMDMs和DCs在誘導(dǎo)OT-I CD8+（圖3J）和OT-II CD4+（圖3K） T細(xì)胞增殖方面更優(yōu)越。此外，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）評(píng)估，BMDMs和DCs的PKCδ缺乏顯著增加OT-I和OT-II共培養(yǎng)上清中IFN-γ的產(chǎn)生（圖3L）。研究結(jié)果表明，PKCδ在調(diào)節(jié)MP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化中至關(guān)重要。

5、PKCδ的內(nèi)在缺失觸發(fā)MPs中I型和II型IFN信號(hào)

         為了了解PKCδ如何調(diào)節(jié)MPs，作者使用來(lái)自Prkcd?/?和Prkcd+/+ M1樣BMDMs，刺激DC （DCstim）， iMCs和整個(gè)E0771腫瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。作者在Prkcd?/?M1 bmdm、DCstim和iMCs中分別鑒定出552、754和219個(gè)基因上調(diào)，而在這些細(xì)胞中分別鑒定出391、905和186個(gè)基因下調(diào)（圖4A、E和I）。GSEA顯示，對(duì)IFN-α/γ標(biāo)志通路的反應(yīng)在Prkcd?/?M1 bmdm（圖4,B至D）、DCstim（圖4,F至H）、iMCs（圖4,J至L）和E0771腫瘤（圖4,M至O）中持續(xù)高度富集，這表明在pkc δ缺陷的MPs中觸發(fā)了I型和II型IFN信號(hào)通路。

         I型和II型IFNs誘導(dǎo)的基因組有很大的重疊，兩者都是誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和保護(hù)性免疫所必需的。因此，作者從對(duì)IFN-α（18個(gè)基因）的反應(yīng)（圖4P）和對(duì)IFN-γ（26個(gè)基因）的反應(yīng)（圖4Q）兩種標(biāo)志基因集研究了Prkcd?/?M1 BMDM、DCstim、iMCs和E0771腫瘤之間共同富集的基因。作者在兩個(gè)IFN基因集之間發(fā)現(xiàn)了11個(gè)重疊基因（圖4R），這些基因可能代表了PKCδ缺陷型MPs中最常見(jiàn)的上調(diào)IFN應(yīng)答基因?？傊?，作者的研究結(jié)果揭示了PKCδ在MPs中促進(jìn)腫瘤和抗炎途徑，同時(shí)抑制I型和II型IFN途徑的潛在作用。

圖4 PKCδ的內(nèi)在缺失觸發(fā)MPs中I型和II型IFN信號(hào)

6、PKCδ缺乏增強(qiáng)抗PD -1治療

         在Prkcd?/?小鼠中觀察到的抗腫瘤效應(yīng)促使作者確定是否PKCδ缺乏可以提高對(duì)ICB的反應(yīng)性。作者選擇了先前報(bào)道的對(duì)ICB相對(duì)耐藥的LLC腫瘤模型。如圖5A所示，作者使用抗PD-1或免疫球蛋白G2a （IgG2a）對(duì)照治療了攜帶LLC腫瘤的Prkcd+/+和Prkcd?/?小鼠。雖然作者觀察到與IgG2a治療的Prkcd+/+小鼠相比，抗PD-1治療的Prkcd+/+小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有中度但顯著的減少，但PKCδ缺陷和抗PD-1的聯(lián)合治療可協(xié)同延緩腫瘤生長(zhǎng)（圖5B和C）。值得注意的是，與其他組相比，接受抗PD -1治療的Prkcd - / -小鼠的總生存期顯著延長(zhǎng)（圖5D）。總之，作者的研究結(jié)果表明PKCδ可能是改善對(duì)ICB反應(yīng)性的一個(gè)有希望的靶標(biāo)。

圖5 PKCδ缺失可改善對(duì)抗PD-1治療的應(yīng)答

結(jié)論：

         這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了一種免疫逃避機(jī)制，MPs通過(guò)PKCδ信號(hào)抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。在這種情況下，PKCδ作為先天免疫檢查點(diǎn)。研究結(jié)果突出了兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):（i） MPs在控制抗腫瘤免疫中的重要性;（ii） PKCδ是TME中MPs表型的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，也是癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)。數(shù)據(jù)還表明，T細(xì)胞PKCδ可能不是TME的關(guān)鍵，而PKCδ在抗腫瘤免疫的背景下在調(diào)節(jié)髓細(xì)胞活化中發(fā)揮更大的作用，PKCδ表達(dá)與免疫抑制性TME相關(guān)。PKCδ抑制IFN信號(hào)的確切分子相互作用將是未來(lái)研究的主題。綜上所述，這項(xiàng)研究表明PKCδ是TME中MP腫瘤表型的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，揭示了腫瘤免疫治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法：

         腫瘤小鼠模型及OT-I T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)；抗PD-1腫瘤研究；體內(nèi)MP消耗研究；體內(nèi)巨噬細(xì)胞共注射研究；小鼠腫瘤單細(xì)胞的分離；流式細(xì)胞儀分析；BMDMs、DCs和iMCs的分離和刺激；抗原呈遞和交叉呈遞實(shí)驗(yàn)和ELISA；RNA測(cè)序；RNA-seq分析；基因集富集分析；scRNA-seq分析。

參考文獻(xiàn)：

         Chaib M, Holt JR, Fisher EL, Sipe LM, Bohm MS, Joseph SC, Simmons BW, Eugin Simon S, Yarbro JR, Tanveer U, Halle JL, Carson JA, Hollingsworth TJ, Wei Q, Rathmell JC, Thomas PG, Hayes DN, Makowski L. Protein kinase C delta regulates mononuclear phagocytes and hinders response to immunotherapy in cancer. Sci Adv. 2023 Dec 22;9(51):eadd3231. doi: 10.1126/sciadv.add3231. Epub 2023 Dec 22. PMID: 38134280; PMCID: PMC10745701.