METTL16的乳酸化通過FDX1 mRNA的m6A修飾促進銅死亡

         m6A是RNA的一種表觀遺傳修飾，將這種化學標記添加到RNA分子中，通過影響RNA分子的命運來調(diào)節(jié)基因表達。這種轉(zhuǎn)錄后RNA修飾是可逆的，由甲基轉(zhuǎn)移酶“writers”和去甲基化酶“erasers”調(diào)節(jié)。m6A修飾的RNA的命運取決于識別和結(jié)合它們的不同“readers”的功能。由于m6A甲基化修飾在調(diào)節(jié)癌癥進展中的重要作用。下圖為2023年m6A修飾的中標項目：

         胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。幽門螺桿菌感染、過量攝入鹽和硝酸鹽以及其他環(huán)境風險因素對胃癌的發(fā)生有很大影響。此外，遺傳改變和宿主因素也與GC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。盡管手術(shù)和輔助治療方法有所改善，但晚期GC患者的預后仍然較差，5年生存率<25%。更好地了解這種致命疾病的潛在機制并制定更有效的靶向治療策略對于改善胃食癌患者的臨床結(jié)果是必要的。該文章于2023年10月發(fā)表在《nature communication》，IF：16.6

技術(shù)路線： 

研究結(jié)果：

1.胃癌中銅含量過高，與腫瘤進展有關(guān)

         銅死亡是由銅濃度過高引起的，但腫瘤中銅死亡的調(diào)控機制仍有待探索。由于銅主要通過胃和小腸上部吸收，胃腸道腫瘤適合研究銅增生的發(fā)生和發(fā)展。我們分析了48對胃癌組織和鄰近組織中的銅濃度，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的銅濃度高于正常胃組織(圖1A, P < 0.01)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，III期胃癌患者的相對銅含量高于I期和II期胃癌患者(圖1B, P < 0.05)，表明銅含量與腫瘤進展相關(guān)。此外，銅含量與GC患者的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)呈負相關(guān)(圖1C, d;log-rank P < 0.05)。同時，銅含量與細胞增殖指標Ki-67的表達呈正相關(guān)(圖1E)。同樣，銅含量與患者血清標本中血小板/淋巴細胞比率和中性粒細胞/淋巴細胞比率呈正相關(guān)，這兩者都是GC浸潤性惡性腫瘤炎癥相關(guān)的預后生物標志物(圖1F, G)。這些結(jié)果表明，高銅含量參與了GC的進展和發(fā)展。此外，我們還檢測了不同GC類型中銅濃度的差異，特別是在惡性腫瘤類型中。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)粘液腺癌中的銅濃度高于整個胃腫瘤(圖1H)。在粘液腺癌中，銅含量與浸潤性指標如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖1I)和血管浸潤(圖1J)呈正相關(guān)。黏液性腺癌是一種罕見的組織學亞型，與非黏液性腺癌相比，黏液性腺癌的分期更晚期，5年OS和DFS更差。粘液腺癌是一種難治性胃癌，具有放化療耐藥的特點，迫切需要更有效的治療方法。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，高細胞內(nèi)銅濃度觸發(fā)還原酶FDX1將Cu2+還原為毒性更強的Cu+形式，導致銅死亡。我們發(fā)現(xiàn)，與正常胃組織相比，GC中的FDX1蛋白水平更高(圖1K)。由于GC中FDX1蛋白水平和銅含量較高，可能更容易引發(fā)銅沉積。它為胃癌提供了一種潛在的治療策略，特別是對惡性腫瘤-粘液腺癌。

圖1. 胃癌中銅含量過高，與腫瘤進展有關(guān)

2.METTL16是銅死亡的關(guān)鍵介質(zhì)

         有報道稱，與良性胃病和健康對照患者相比，胃癌組的總m6A水平顯著升高，并促進胃癌發(fā)生、生長、侵襲、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)、轉(zhuǎn)移甚至多藥耐藥的過程。然而，m6A修飾與銅突的關(guān)系仍不清楚。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)銅含量與GC組織中總m6A水平呈正相關(guān)(R = 0.5116)(圖2A)。此外，銅顯著上調(diào)GC細胞中m6 A修飾的總水平(圖2B)。考慮到甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(METTL)家族在促進m6A修飾中起主導作用，我們分析了以1:1比例使用埃司氯莫爾/雙硫拉姆和銅處理METTL敲低細胞的活力。結(jié)果表明，METTL16敲低導致對埃司克洛莫爾/雙硫侖-銅處理產(chǎn)生耐藥性(圖2C-E)。此外，四硫鉬酸鹽(TTM)是一種銅體變形抑制劑，在對照細胞和METTL16敲低的細胞中抑制了銅體變形，表明METTL16參與了銅體變形(圖2F)。觀察到的結(jié)果與METTL16敲除克隆細胞系相似(圖2G, H)。這些結(jié)果表明，METTL16在銅增生中起著至關(guān)重要的作用。

圖2. METTL16是銅死亡的關(guān)鍵介質(zhì)

3.METTL16通過靶向FDX1促進銅死亡

         METTL16在許多轉(zhuǎn)錄中負責m6 A的沉積。因此，在穩(wěn)定的穩(wěn)敲對照和穩(wěn)敲METTL16細胞系中進行甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)測序(圖3A)。。使用HOMER軟件預測每個樣品中潛在的m6 A修飾，m6 A修飾主要映射到經(jīng)典的GGAC基序(圖3B)。GO富集分析顯示，mettl16修飾基因富集了前15條通路，其中一些與線粒體通路相關(guān)(圖3C)。此外，我們從銅質(zhì)增生相關(guān)通路中發(fā)現(xiàn)了10個與METTL16穩(wěn)敲組中m6A甲基化水平低以及mRNA水平下調(diào)相關(guān)的典型因子(圖3D。qPCR分析顯示，METTL16穩(wěn)敲細胞中FDX1、MTF1、PDHB、ATP7A和DLD mRNA水平降低。與對照細胞相比，F(xiàn)DX1在METTL16-sh細胞中的mRNA水平下降最為顯著(圖3E)。此外，在METTL16- sh或-KO細胞中檢測到FDX1蛋白水平顯著降低(圖3F, G)?？紤]到FDX1是銅離子載體誘導細胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，我們推測METTL16誘導的銅細胞凋亡依賴于FDX1。接下來，我們評估METTL16是否通過影響FDX1的表達來調(diào)節(jié)銅死亡。鑒于蛋白質(zhì)脂?；倾~氧化的關(guān)鍵因素，我們使用硫辛酸特異性抗體作為DLAT脂?；臏y量，評估了METTL16敲低是否會影響蛋白質(zhì)脂酰化。結(jié)果顯示，METTL16敲低導致DLAT脂?；档停ㄟ^免疫印跡檢測(圖3H)。此外，在 METTL16-Sh 或 -KO 細胞中檢測到 FDX1 蛋白水平顯著降低 (3F,G)?？紤]到FDX1是銅離子載體誘導細胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，我們推測METTL16通過FDX1誘導銅死亡。

圖3. METTL16通過靶向FDX1促進銅死亡

4.METTL16通過 FDX1 mRNA的m6A修飾促進 FDX1 的積累

         為了進一步探討METTL16如何調(diào)控m6 A修飾從而影響FDX1 mRNA水平，我們進行了基因特異性MeRIP-qPCR分析。我們發(fā)現(xiàn)，在METTL16敲除和敲除細胞中，F(xiàn)DX1 mRNA上的m6 A水平顯著降低在轉(zhuǎn)染mettl16過表達質(zhì)粒的細胞中顯著增加(圖4A, B)。當使用放線菌素D (ActD)停止轉(zhuǎn)錄時，mettl16敲除細胞中FDX1 mRNA的衰減速度比對照細胞快(圖4C)。。這些結(jié)果表明mettl16介導的甲基化導致FDX1 mRNA的穩(wěn)定性。整合基因組學觀察(IGV)分析FDX1富集的m6 A峰顯示，與對照細胞(紅色峰)相比，METTL16-sh細胞(綠色峰)中的m6 A水平降低，表明METTL16可能促進FDX1在CDS或3'UTR區(qū)域的m6 A修飾(圖4D)。因此，我們將FDX1的部分CDS融合到pGL3熒光素酶報告基因下游，構(gòu)建FDX1- wt熒光素酶報告基因。通過共轉(zhuǎn)染FDX1熒光素酶報告基因和不同劑量的METTL16- oe質(zhì)粒，我們發(fā)現(xiàn)METTL16顯著提高了FDX1熒光素酶的活性(圖4E)。

         為了進一步探索它，我們使用SRAMP(基于序列的m6A修飾位點預測器)預測了FDX1 mRNA上可能的m6A修飾位點。綜合圖4e的預測結(jié)果和數(shù)據(jù)，我們以非常高的置信度確定了兩個潛在的m6 A修飾位點:FDX1轉(zhuǎn)錄本的CDS區(qū)域602a位點和UTR區(qū)域820 A位點(圖4F, G)。隨后使用特異性引物進行MeRIP-qPCR分析，證明FDX1轉(zhuǎn)錄本上的602位點是mettl16介導的甲基化的直接底物(圖4H)。此外，我們基于FDX1-WT熒光素酶報告基因，用胸腺嘧啶(T)取代m6A基序中的特異性腺苷(A)，設(shè)計并構(gòu)建了FDX1-602-Mut和FDX1-820-Mut熒光素酶報告基因(圖4H)。雙熒光素酶檢測結(jié)果表明，METTL16不能促進602位點突變的FDX1-CDS/UTR報告基因構(gòu)建體的熒光素酶活性(圖4I)。對GEPIA數(shù)據(jù)庫中METTL16和FDX1的表達分析表明，METTL16和FDX1在GC中呈正相關(guān)(圖4j)。此外，免疫組織化學染色顯示，在包含54對GC和鄰近正常組織的組織芯片中，METTL16的表達與FDX1的表達呈正相關(guān)(圖4K)。綜上所述，這些結(jié)果證實了mettl16介導的FDX1 mRNA上的m6 A修飾對FDX1 mRNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

圖4.  METTL16通過 FDX1 mRNA的m6A修飾促進 FDX1 的積累

5.METTL16在銅脅迫下在 K229 位點乳酸化

         接下來，我們評估了METTL16是否對GC中的銅脅迫有反應。銅處理后，METTL16 mRNA和蛋白水平不變，但FDX1蛋白水平顯著升高(圖5A, B)。為了驗證銅脅迫下FDX1表達上調(diào)是否依賴于METTL16，我們測量了在存在或不存在銅的情況下，METTL16敲除或敲除細胞中FDX1蛋白的表達。結(jié)果顯示，METTL16缺乏消除了銅誘導的FDX1上調(diào)(圖5C, D)。由于METTL16 mRNA和蛋白水平在銅脅迫下保持不變，我們隨后使用質(zhì)譜法測量了METTL16 PTM的變化。分析顯示，METTL16蛋白序列上有11個乳酸化位點和2個乙酰化位點(圖5E)。乳酸處理后，6個乳酸化位點(紅色)的PTM水平顯著升高，提示這6個位點在腫瘤細胞中可能受到調(diào)控。然后我們證實了對銅脅迫的乳酸化或乙酰化反應的存在。結(jié)果顯示，銅處理顯著提高了METTL16的乳酸化水平，而不是乙酰化水平(圖5F)。為了確定METTL16在銅相關(guān)代謝中的重要乳酸化位點，我們生成了這6個乳酸化位點的乳酸化缺陷突變體(K ~ R)和K410(作為代表位點，其乳酸化在乳酸脅迫下保持不變)。我們發(fā)現(xiàn)只有METTL16-K229R突變體在銅脅迫下顯示乳酸化減少(圖5G)。隨后，通過LC-MS/MS分析得到METTL16-K229與其他乳酸化位點的b-y離子匹配圖(圖5H)。為了進一步證實銅脅迫下METTL16-K229的乳酸化，我們生成了一種METTL16乳酸-K229抗體，并利用乳酸-K229肽和表達METTL16- wt、-K229R或-K229E的細胞來驗證其有效性和特異性(圖5I, J)。銅和乳酸處理均誘導K229發(fā)生強烈的METTL16乳酸化(圖5k, l)，表明K229是銅相關(guān)代謝中必需的乳酸化位點。這些結(jié)果表明，銅脅迫下METTL16在K229位點發(fā)生乳酸化。在穩(wěn)定的METTL16拯救(METTL16-WT、-K229R或-K229E)細胞系中，內(nèi)源性METTL16被野生型(WT)、乳酸化缺陷(K229R)或乳酸化模擬(K229E)取代，進一步確保了FDX1蛋白水平。結(jié)果顯示，mettl16敲除細胞中FDX1蛋白水平下降，在METTL16-WT或-K229E拯救細胞后恢復，但METTL16-K229R拯救細胞中沒有恢復(圖5M)。綜上所述，銅脅迫誘導了METTL16- k229的乳酸化，并促進了METTL16的甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

圖5.  METTL16在銅脅迫下在 K229 位點乳酸化

6.SIRT2 使 METTL16-K229 脫乳酸并抑制METTL16活性

         SIRT2被鑒定為METTL16的結(jié)合蛋白，是一種典型的去乙?；?，分為主要的去乙?；负腿樗徂D(zhuǎn)移酶組(圖6A)。EIF3b也被鑒定為METTL16的結(jié)合蛋白，與以往的研究一致29。為了研究和驗證METTL16和SIRT2之間的相互作用，在HGC-27細胞中檢測到METTL16-SIRT2結(jié)合(圖6B)。使用His-pull-down試驗驗證了METTL16-SIRT2的直接關(guān)聯(lián)(圖6C)。METTL16-K229的乳酸化被SIRT2過表達顯著抑制(圖6D)，并被SIRT2敲低或用SIRT2抑制劑- AGK2處理促進(圖6E)。

         此外，銅誘導的METTL16-K229的乳酸化被SIRT2過表達抑制，而被SIRT2敲低或AGK2處理增加(圖6F, G)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明SIRT2與K229位點的METTL16相互作用并使其去乙?；Ｎ覀冞M一步探討了SIRT2在穩(wěn)定的METTL16拯救(METTL16- wt， -K229R或-K229E)細胞系中對METTL16的調(diào)控作用。SIRT2過表達抑制了METTL16- wt細胞中的FDX1 m6 A水平，但在METTL16- k229r或-K229E細胞中沒有，這表明SIRT2通過METTL16- k229的乳酸化抑制了METTL16的活性(圖6H, I)。此外，SIRT2過表達抑制了FDX1蛋白水平(圖6J)，而SIRT2敲低和AGK2處理促進了FDX1蛋白水平(圖6K)。免疫熒光染色(IF)結(jié)果顯示，GC組織芯片中SIRT2蛋白水平與FDX1蛋白水平呈負相關(guān)(圖6l)。

圖6. SIRT2 使 METTL16-K229 脫乳酸并抑制METTL16活性

7.SIRT2-METTL16-FDX1-銅死亡軸支持一種有前途的治療策略

         FDX1是銅質(zhì)增生的重要介質(zhì)，銅質(zhì)增生是一種潛在的癌癥治療方法53。我們發(fā)現(xiàn)，在sirt2抑制或銅誘導的METTL16-K229乳酸化后，F(xiàn)DX1蛋白水平升高。接下來，我們研究了METTL16-K229乳酸化對銅生長的影響。結(jié)果顯示，銅脅迫下METTL16敲低介導的DLAT脂?；档驮贛ETTL16- wt /-K229E細胞中得以恢復，但在METTL16- k229r細胞中沒有恢復(圖7A)。此外，在銅存在的情況下，elesclool處理在METTL16-WT或-K229E細胞中誘導銅變性，但在METTL16-K229R細胞中沒有(圖7B)。此外，SIRT2過表達逆轉(zhuǎn)了銅脅迫下METTL16-WT誘導的DLAT脂?；脑黾?，但沒有逆轉(zhuǎn)METT16-K229E誘導的DLAT脂?；?，這表明SIRT2通過使METTL16K229去乙酰化來抑制cupropsis(圖7C)。與此一致的是，AGK2處理促進了METTL16-WT細胞中的DLAT脂?；?，而在銅脅迫下的METTL16-K229R細胞中則沒有(圖7D)。此外，在埃司克洛莫爾和銅存在的情況下，AGK2治療促進銅增生(圖7E)。我們進一步評估了METTL16乳酸化是否能增強接受埃司洛莫爾治療的小鼠異種移植腫瘤的治療反應。將METTL16-WT、-K229R、-K229E細胞皮下注射到裸鼠左右后腿上方。METTL16-WT組和-K229E組小鼠腫瘤生長明顯受到抑制，而METTL16-K229R組則沒有，通過腫瘤體積和重量的減少可以觀察到(圖7F-H)。腫瘤切片F(xiàn)DX1染色在METTL16-WT和-K229E組中高于METTL16-K229R組(圖7I)。這些結(jié)果表明，K229位點METTL16的乳酸化狀態(tài)在銅質(zhì)增生的決定中起著至關(guān)重要的作用。此外，在異種腫瘤移植中使用埃司克洛莫爾和AGK2聯(lián)合治療。腫瘤切片分析顯示，AGK2在體內(nèi)對埃司氯莫爾治療增敏，通過腫瘤體積和重量的減少可以觀察到(圖7J - L)。這些結(jié)果表明，埃雷斯洛莫爾和AGK2聯(lián)合治療胃癌，特別是惡性腫瘤-粘液腺癌(高銅含量)是有希望的治療方法。

圖7.SIRT2-METTL16-FDX1-銅死亡軸支持一種有前途的治療策略

結(jié)論：

         在這里，我們證明了研究團隊發(fā)現(xiàn)銅離子促進了胃癌的整體m6A修飾，其中METTL16介導的FDX1 mRNA - m6A在促進銅死亡方面起到關(guān)鍵作用。具體而言，銅離子通過調(diào)控乳酰化酶和去乳?；窼IRT2 調(diào)控METTL16-K229乳?；?，從而調(diào)控其活性。乳酰化的METTL16引起FDX1-602位點發(fā)生甲基化修飾，促進FDX1表達，導致銅死亡發(fā)生。SIRT2是一種典型的去乙酰化酶，其抑制劑AGK2在該途徑中可以顯著促進METTL16的乳?；癋DX1的m6A修飾，促進銅死亡。因此，AGK2聯(lián)合銅死亡誘導劑伊利司莫（Eles），可以促進惡性胃癌的治療。

實驗方法：

         WB、q-RTPCR、異種移植瘤實驗、穩(wěn)定細胞系構(gòu)建、m6斑點印跡測定、熒光素酶報告基因檢測、His-pull-down測定、IP、免疫熒光、MeRIP-qPCR、甲基化RNA免疫沉淀測序、RIP、體外乳酸化測定

參考文獻：

         Sun L, Zhang Y, Yang B, et al. Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 2023;14(1):6523. Published 2023 Oct 20.