EGFR激活肌成纖維細胞促進胰腺癌轉(zhuǎn)移
胰腺導(dǎo)管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma，PDAC）是一種高度侵襲性和難治性疾病，預(yù)后很差。癌癥相關(guān)成纖維細胞（Cancer-associated Fibroblasts，CAFs）是公認的潛在治療靶點，但對異質(zhì)性細胞群的了解不足限制了治療。本研究表明肌成纖維細胞（myofibroblastic CAFs，myCAFs）中轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming Growth Factor Beta，TGF-β）通過雙調(diào)蛋白介導(dǎo)的自分泌過程誘導(dǎo)EGFR/ERBB2信號的傳導(dǎo)。在PDAC類器官衍生培養(yǎng)物和小鼠模型中抑制EGFR/ERBB2信號對不同CAF亞型的影響不同，為其異質(zhì)性的機制提供了見解。值得注意的是，EGFR激活的myCAFs促進小鼠PDAC轉(zhuǎn)移，揭示了myCAF異質(zhì)性中的功能意義。最后，對其他癌癥數(shù)據(jù)集的分析表明，這些過程可能在其他惡性腫瘤中起作用這些數(shù)據(jù)為myCAF異質(zhì)性提供了功能相關(guān)性，并確定了PDAC中預(yù)防腫瘤侵襲的候選靶點。
該研究于2023年12月28日發(fā)表在《Cancer Cell》，IF：50.3。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. TGF-β和PDAC類器官條件培養(yǎng)基激活myCAFs中的EGFR/ERBB2信號傳導(dǎo)
TGF-β信號傳導(dǎo)促進PDAC myCAFs的形成和增殖，但尚不清楚該途徑是否在這些細胞中發(fā)揮其他功能。因此，作者描述了PDAC CAF前體細胞——胰腺星狀細胞（Pancreatic Stellate Cells，PSCs）——TGF-β處理后受體酪氨酸激酶（RTK）的磷酸化。磷酸化表皮生長因子受體（p-EGFR）和磷酸化Erb-B2受體（p-ERBB2）是TGF-β處理后激活的最豐富的RTK，與對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的靜止PSCs相比，它們的水平顯著增加（圖1A和1B）。此外，單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)集的分析證實了EGFR和ERBB2在小鼠和人中PDAC CAFs的表達。PSC中TGF-β受體II（TGFBR2）的缺失阻斷了TGF-β應(yīng)答基因的誘導(dǎo)、TGF-β依賴性增生和EGFR的激活。這表明TGF-β通過其同源受體TGFBR2激活EGFR。此外，PSC中EGFR和ERBB2的激活快速且持續(xù)抑制TGF-β受體I（TGFBR1）（TGFBR1i）（圖1C-E）。由于TGF-β治療4天后仍觀察到持續(xù)的EGFR/ERBB2激活，作者在該時間點對TGF-β-處理的PSCs和對照進行RNA-seq。TGF-β處理的PSCs富集了已知的myCAF相關(guān)途徑，包括細胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)、TGF-β-依賴性LRRC15+CAF和iCAF特征（圖1F、1G）。這些結(jié)果驗證了TGF-β處理的PSCs myCAFs中激活的信號通路。此外，該分析顯示TGF-β誘導(dǎo)的myCAFs中膽固醇生成相關(guān)特征顯著富集（圖1G）。此外，TGF-β處理PSCs還誘導(dǎo)了與EGFR激活相關(guān)的特征，包括KRAS信號傳導(dǎo)、MAPK信號傳導(dǎo)和Dusp6（ERK通路的已知靶點）表達增加（圖1F和1G）。
在體外和體內(nèi)，PDAC惡性細胞均表達TGF-β。此外，PDAC類器官條件培養(yǎng)基（CM）可激活PSC中TGF-β通路的下游成員SMAD2，而在CM處理的PSC中，抑制TGF-β信號傳導(dǎo)可增強iCAF表型。這些結(jié)果表明，PDAC類器官CM治療PSC可激活myCAF。因此，在PDAC類器官分泌TGF-β基礎(chǔ)上，評估了PDAC類器官CM是否激活PSC中的EGFR/ERBB2信號傳導(dǎo)。PDAC類器官CM誘導(dǎo)PSC中的EGFR和ERBB2激活，這被EGFR和ERBB2受體雙重抑制劑（ERBBi）內(nèi)拉替尼阻斷（圖2A）。除了TGF-β，PDAC類器官還表達EGFR/ERBB2配體，這可能有助于促進myCAFF中EGFR/ERBB2的激活。為了更好地表征EGFR/ERBB2激活的CAFs，作者在存在或不存在ERBBi的情況下對CM處理的PSCs進行RNA-seq。通過將TGF-β和CM誘導(dǎo)的基因與EGFR/ERBB2抑制下調(diào)的基因交叉，發(fā)現(xiàn)了體外myCAF衍生的52個基因的ERBB特征（圖2B）。CM處理的PSCs上調(diào)了KRAS信號傳導(dǎo)和Dusp6表達，這些效應(yīng)被ERBBi阻斷，而沒有顯著改變TGF-β信號傳導(dǎo)激活（圖2C、2D）。此外，膽固醇b生成相關(guān)特征是myCAF衍生的ERBB特征中最顯著豐富的途徑之一（圖2C和2D）。
總之，這些數(shù)據(jù)支持PDAC惡性細胞分泌的TGF-β激活小鼠和人PDAC中myCAFs中EGFR信號傳導(dǎo)。
圖1：TGF-β激活myCAFs中EGFR/ERBB2信號傳導(dǎo)
圖2：myCAFs中TGF-β誘導(dǎo)的自分泌雙調(diào)蛋白激活EGFR信號
2.TGF-β誘導(dǎo)的自分泌雙調(diào)蛋白激活myCAFs中的EGFR信號傳導(dǎo)
在TGF-β處理30分鐘后，PSCs中EGFR信號的早期激活似乎是由增加的受體介導(dǎo)的（圖1D）。為了研究TGF-β誘導(dǎo)的myCAFs中EGFR的激活如何持續(xù)，作者在RNA-seq圖譜中尋找TGF-β或PDAC類器官CM培養(yǎng)的PSCs，ERBBi存在或不存在時EGFR/ERBB2配體表達。圖譜確定了EGFR/ERBB2配體，包括TGF-β顯著誘導(dǎo)的雙調(diào)節(jié)蛋白（Areg）和肝素結(jié)合EGF-樣生長因子（Hbegf）（圖2E）。RT-qPCR分析證實了TGF-β-誘導(dǎo)的PSC中Areg和Hbegf的表達，Tgfbr2 KO或TGFBR1抑制劑（TGFBR1i）A83-01治療阻止Areg的表達（圖2F和S2D）。此外，在Egfr或Erbb2缺失或藥理抑制后，Areg和Hbegf表達部分缺失，這表明了Areg和Hbegf作為體外TGF-β誘導(dǎo)的myCAFs中EGFR激活的候選介質(zhì)（圖2F）。然而，Areg是TGF-β和PDAC類器官CM治療顯著誘導(dǎo)的EGFR/ERBB2唯一配體（圖2E）。此外，PSC中TGF-β上調(diào)AREG蛋白，Tgfbr2缺失或TGFBR1藥物抑制完全阻斷AREG蛋白，但Egfr或Erbb2缺失或抑制并不能阻斷AREG蛋白（圖2G）。在TGF-β誘導(dǎo)的myCAFs中，直接測試了AREG是否介導(dǎo)EGFR信號的激活，PSCs中刪除Areg基因（圖2H）。與對照組相比，AREG誘導(dǎo)的EGFR持續(xù)激活在AREG KO PSCs中減少（圖2I）。
因此，PDAC myCAFs中，自分泌AREG介導(dǎo)EGFR激活下游的TGF-β信號
3. 體外抑制EGFR/ERBB2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)耗盡myCAFs
為了進一步了解EGFR/ERBB2激活如何影響myCAFs，首先測量了立即或延遲（72小時）暴露于ERBBi后PSC的增殖，發(fā)現(xiàn)增殖顯著減少，而凋亡沒有增加，這表明EGFR/ERBB2信號傳導(dǎo)介導(dǎo)了TGF-β-誘導(dǎo)的myCAFs的增殖（圖3A、3B）。此外，體外和體內(nèi)iCAF的缺氧特征在EGFR/ERBB2抑制后增加，相反的，EGFR/ERBB2抑制下調(diào)已知的myCAF相關(guān)特征（圖3C）。RT-qPCR分析證實了EGFR/ERBB2抑制后iCAF標記的上調(diào)（圖3D）。當PSCs和PDAC類器官在transwell中共培養(yǎng)時，即使PDAC類器官增殖通過ERBBi治療而減少（圖3E），也觀察到這種效果。
為了分析更接近體內(nèi)情況的模型，建立了PDAC類器官與Egfr WT或Egfr KO PSC的共培養(yǎng)物。然后通過RNA-seq分析流動排序的惡性細胞和PSC群體（圖3F和3G）。與對照相比，Egfr耗竭時PSC中大多數(shù)下調(diào)通路由已知的myCAF相關(guān)特征構(gòu)成（圖3H；表S3）。雖然缺氧和體外iCAF特征也被下調(diào)，但這可能是由于共培養(yǎng)的惡性細胞的變化，而不是Egfr損失的直接影響。
總而言之，這些數(shù)據(jù)表明EGFR/ERBB2抑制優(yōu)先針對體外的myCAFs，且只有myCAFs的亞群被耗盡。此外，這些分析突出顯示如何聯(lián)合EGFR/ERBB2抑制，而不是EGFR封鎖單獨，可能需要體內(nèi)有效靶向EGFR激活的myCAFs。
圖3：體外抑制EGFR/ERBB2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)耗盡myCAFs
4. 抑制EGFR/ERBB2信號優(yōu)先靶向體內(nèi)myCAFs
為了確定EGFR/ERBB2信號抑制是否差異影響體內(nèi)不同的CAF亞型，作者用PDAC類器官建立了原位移植小鼠模型，并用EGFR/ERBB2抑制劑（ERBBi）neratinib治療荷瘤小鼠2周（圖4A）。盡管ERBBi治療后apCAFs沒有顯著改變，但myCAFs減少，iCAFs增加，PDAC腫瘤中myCAF/非myCAF的比例顯著改變（圖4B、4C）。雖然已被證明藥物抑制時對CAFs形成途徑的相互轉(zhuǎn)換，但這是否與本研究相關(guān)仍有待確定。為了進一步研究EGFR/ERBB2抑制對CAFs的影響，作者建立了另外的PDAC類器官來源的原位移植小鼠模型，并在流式分選惡性細胞和成纖維細胞群體進行RNA-seq分析之前，用ERBBi或載體治療荷瘤小鼠2周（圖4A和4D）。與EGFR/ERBB2激活發(fā)生在myCAFs中的發(fā)現(xiàn)一致，與載體治療腫瘤的CAFs相比，來自ERBBi治療腫瘤的CAFs顯著下調(diào)了Areg表達和TGF-β誘導(dǎo)的myCAF特征，并顯著上調(diào)了體內(nèi)iCAF特征（圖4E）。此外，先前確定的myCAF亞群如TGF-β依賴性LRRC15+CAFs的特征不受ERBBi治療的影響，表明EGFR/ERBB2抑制可能只會耗盡myCAFs的一個子集。
為了驗證上述發(fā)現(xiàn)并進一步研究EGFR/ERBB2抑制后CAF群體的變化，作者對用ERBBi或載體治療2周的PDAC腫瘤進行了單核RNA測序（snRNA-seq）（圖4A、4F、4G）。Dusp6表達的下調(diào)證實了多種細胞類型中對該通路的靶向作用，DEGs分析確定上皮細胞和CAFs是EGFR/ERBB2抑制后受影響最大的細胞群體（圖4H）。與載體治療的腫瘤相比，ERBBi治療的PDAC腫瘤中iCAF豐度和iCAF相關(guān)特征豐富，而myCAF豐度和myCAF相關(guān)特征下調(diào)（圖4I-4L）。最后，雖然原發(fā)性腫瘤生長和腹水和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率沒有顯著影響，但EGFR/ERBB2抑制導(dǎo)致膈肌和肺轉(zhuǎn)移的小鼠明顯減少（圖4M）。
總之，這些數(shù)據(jù)表明體內(nèi)PDAC抑制EGFR/ERBB2靶向myCAFs，并表明在myCAFs的一個亞群中的EGFR/ERBB2通路抑制可能會損害PDAC轉(zhuǎn)移形成。
圖4：體內(nèi)抑制EGFR/ERBB2信號優(yōu)先靶向myCAFs
5. 抑制EGFR/ERBB2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)耗盡myCAFs的亞群
雖然數(shù)據(jù)表明EGFR激活的myCAFs在PDAC中具有潛在的轉(zhuǎn)移促進作用，但有文獻表明，α-平滑肌肌動蛋白（αSMA）陽性或HH激活的肌成纖維細胞和細胞外基質(zhì)成分（如膠原）抑制PDAC進展。與些先前研究以及TGF-β3或HH信號傳導(dǎo)抑制相比，ERBBi治療并未減少整體膠原沉積或肌成纖維細胞標志物αSMA的水平（圖5A-5C）。因此，作者評估了EGFR/ERBB2抑制是否僅針對PDAC腫瘤中myCAFs的一個亞群。作者之前研究發(fā)現(xiàn)Thy1（編碼CD90）在myCAFs中高度表達。為了調(diào)查ERBBi治療對myCAFs子集的潛在差異影響，作者評估了CD90-或CD90+myCAFs（如CD31-CD45-EpCAM-PDPN+Ly6C-MHCII-）豐度的變化。發(fā)消息，EGFR/ERBB2抑制對myCAFs的消耗僅限于CD90?myCAFs，在CD90+myCAFs中有適度增加（圖5D）。
為了更好地表征CD90- 和CD90+myCAF群體，建立了PDAC的原位嫁接類器官衍生小鼠模型，并在RNA-seq之前對兩個myCAF群體進行了流動排序（圖5E、5F）。RNA-seq分析證實了兩個myCAF群體的流動排序，顯示與CD90+ myCAFs相比，CD90-myCAFs中Thy1表達顯著下調(diào)（圖5G）。與CD90+ myCAFs相比，CD90- myCAFs具有顯著更高水平的Areg和Dusp6，這表明EGFR信號在CD90- myCAF亞群中更高（圖5G）。這些數(shù)據(jù)為EGFR/ERBB2抑制優(yōu)先靶向CD90- myCAFs提供了解釋。此外，與CD90- myCAFs相比，CD90+ myCAFs具有明顯更高的Acta2和Col1a1表達，并且ECM相關(guān)特征富集（圖5H和5I）。因此，上述數(shù)據(jù)表明，由于靶向產(chǎn)生較少ECM的CD90-myCAF亞群，EGFR/ERBB2抑制后膠原沉積和αSMA水平?jīng)]有改變。此外，CD90-myCAFs顯著富集膽固醇生物合成相關(guān)特征，這些特征在體外TGF-β誘導(dǎo)的myCAF和myCAF-衍生的ERBB特征中上調(diào)（圖5I、1G和2C）。此外，CD90- myCAFs顯示出已知體內(nèi)iCAF和myCAF特征的顯著下調(diào)，證實了它們與CD90+myCAFs或其他先前描述的myCAF，包括TGF-β依賴性LRRC15+myCAFs的表型差異（圖5I）。最后，除了Areg，還發(fā)現(xiàn)了許多在CD90?和CD90+myCAFs中差異表達的其他分泌蛋白，它們可能介導(dǎo)這些CAF群體的不同功能。具體來說，CD90+myCAFs富含膠原蛋白，已被證明在PDAC中起到腫瘤抑制作用，而CD90-myCAFs上調(diào)了編碼分泌蛋白的基因，包括Spp1和Sema3e，這些蛋白已被證明促進轉(zhuǎn)移（圖5J）。
總的來說，這些數(shù)據(jù)提供了對myCAF異質(zhì)性的見解，并確定了依賴于EGFR/ERBB2信號激活并可能影響PDAC進展的myCAF亞群。
圖5：抑制EGFR/ERBB2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)耗盡myCAFs亞群
6. EGFR激活的myCAFs促進PDAC轉(zhuǎn)移
在小鼠模型中的ERBBi研究表明，myCAFs中的EGFR/ERBB2抑制可能會損害PDAC轉(zhuǎn)移的形成（圖4M）。然而，已有研究報道過PDAC腫瘤中惡性細胞的EGFR信號傳導(dǎo)，snRNA-seq分析確定上皮細胞是ERBBi治療后PDAC腫瘤中受影響最大的細胞類型（圖4H）。因此，為了研究EGFR激活的myCAFs在PDAC進展中的作用，建立了PDAC類器官單獨或與Egfr WT（如Rosa26 KO）或Egfr KO PSCs共同注射的原位移植小鼠模型（圖6A）。通過IHC檢測與SV40大T抗原永生的共移植PSC，證實EGFR信號在促進CAF增殖。作者評估了CAFs中Egfr缺失后的改變是否與EGFR/ERBB2抑制后觀察到的一致，與PDAC+Egfr WT PSC腫瘤相比，PDAC+Egfr KO PSC腫瘤含有更少的myCAFs，更多的iCAFs（圖6B和圖6C）。值得注意的是，來自PDAC+Egfr WT PSC的腫瘤明顯大于單獨來自PDAC的腫瘤（圖6D）。此外，與EGFR/ERBB2抑制后觀察到的相似，它們產(chǎn)生的隔膜轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移和腹水明顯多于單獨PDAC或PDAC+Egfr KO PSC腫瘤（圖6E-6I）。
為了研究CAFs中的AREG阻斷是否會重現(xiàn)EGFR信號完全消融的影響，建立了PDAC類器官單獨或與Areg WT（即Rosa26 KO）或Areg KO PSC（圖6J和S6I）共同注射的原位移植小鼠模型。與PDAC+Areg WT PSC腫瘤相比，PDAC+Areg KO PSC腫瘤的巨噬細胞明顯減少（圖S6J和S6K）。這些發(fā)現(xiàn)與體外分析一致，顯示Egfr缺失下調(diào)但不完全確實PSC中Areg的表達（圖2F和2G），并表明myCAF產(chǎn)生的AREG在成纖維細胞-巨噬細胞串擾中的作用。此外，PDAC+Areg KO PSC腫瘤在整體CAF豐度或iCAF/myCAF比例方面與PDAC相比沒有顯著差異，這些結(jié)果表明Areg缺失損害但不完全抑制EGFR信號激活，和myCAF形成（圖2I）。PDAC+Areg WT PSC腫瘤明顯大于單獨來自PDAC或PDAC+Areg KO PSC的腫瘤（圖6K）。這些發(fā)現(xiàn)也符合體外分析，顯示Egfr缺失并不完全降低PSC中Areg的表達，并表明myCAF產(chǎn)生的AREG在局部起作用以促進原發(fā)PDAC生長。最后，PSC中的Areg缺失損害了膈肌轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和腹水的形成，但對肺轉(zhuǎn)移沒有影響，進一步突出了CAF介導(dǎo)的PDAC轉(zhuǎn)移過程的復(fù)雜性（圖6L-6N）。
總之，這些數(shù)據(jù)確定了以前未被認識到的myCAFs的功能復(fù)雜性，表明EGFR激活的myCAFs促進PDAC的轉(zhuǎn)移。此外，這些結(jié)果表明，為了更有效地損害其促轉(zhuǎn)移作用，需要完全消融CAFs中的EGFR信號激活，而不是單獨阻斷AREG。
圖6：EGFR激活myCAFs促進PDAC轉(zhuǎn)移
7. EGFR激活的myCAFs促進PDAC惡性細胞的轉(zhuǎn)移潛能
為了研究EGFR激活的CAFs促進PDAC轉(zhuǎn)移的潛在機制，對與Egfr WT或Egfr KO PSCs共培養(yǎng)的PDAC類器官中流式分選的RNA-seq進行分析（圖3F和3G）。結(jié)果看出與Egfr缺失的PSCs培養(yǎng)的類器官中，參與轉(zhuǎn)移形成的通路顯著下調(diào)，包括EMT轉(zhuǎn)換和缺氧基因特征（圖7A）。為了調(diào)查這些變化是否也在體內(nèi)觀察到，建立了PDAC類器官與Egfr WT（即Rosa26 KO）或Egfr KO PSCs共注射的原位移植小鼠模型，并對流式分選的惡性細胞進行RNA-seq（圖7B和7C）。與PDAC+Egfr WT PSC腫瘤流式分選的惡性細胞相比，DAC+Egfr KO PSC分選出的惡性細胞顯示EMT特征下調(diào)（圖7D）。還分析了體內(nèi)EGFR/ERBB2抑制后惡性細胞轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)EGFR激活的myCAFs耗盡。ERBBi-或載體治療2周后，PDAC腫瘤通過流式分選惡性細胞的RNA-seq證實了ERBBi治療后轉(zhuǎn)移相關(guān)通路下調(diào)，包括EMT和缺氧基因特征（圖4A、4D和7E）。這些結(jié)果也通過ERBBi-或載體治療2周的腫瘤中PDAC惡性細胞的snRNA-seq分析得到證實，該分析顯示，與載體治療的腫瘤相比，ERBBi治療的腫瘤上皮細胞中EMT和缺氧基因特征顯著下調(diào)（圖4A、4F-4H）。
總之，這些數(shù)據(jù)支持EGFR激活myCAFs通過增強PDAC惡性細胞的轉(zhuǎn)移潛力促進PDAC轉(zhuǎn)移形成（圖7G）。
圖7：EGFR激活myCAFs促進PDAC惡性細胞的轉(zhuǎn)移潛能
結(jié)論
通過互補的體外和體內(nèi)分析，作者揭示了EGFR激活在PDAC CAFs中以前未知的作用。數(shù)據(jù)顯示TGF-β誘導(dǎo)PDAC myCAFs中的AREG表達，引發(fā)自分泌EGFR/ERBB2反應(yīng)。該網(wǎng)絡(luò)似乎微調(diào)了CAF細胞狀態(tài)的平衡，相對于iCAF表型，更有利于myCAF。因此，EGFR/ERBB2抑制優(yōu)先針對myCAFs而不是iCAFs。此外，體內(nèi)這種效應(yīng)似乎僅限于EGFR信號激活更高的CD90-myCAFs亞群。最后證明了EGFR激活的myCAFs促進小鼠PDAC轉(zhuǎn)移，從而揭示了雙向惡性細胞-成纖維細胞串擾調(diào)節(jié)PDAC myCAF分子和功能異質(zhì)性并驅(qū)動轉(zhuǎn)移的機制。
實驗方法
細胞培養(yǎng)和處理，小鼠實驗，原位移植小鼠模型，蛋白質(zhì)印跡分析，ELISA檢測，擴散分析，免疫組織化學(xué)和組織學(xué)分析，RNA原位雜交分析，流式細胞術(shù)分析，細胞共培養(yǎng)，流式分選，逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)分析，RNA測序和單細胞RNA測序分析，基因集變異分析，單核RNA測序，降維和聚類，差異基因表達(DEG)分析，基因集富集分析
參考文獻
Mucciolo Gianluca, Araos Henríquez Joaquín, Jihad Muntadher, et al. EGFR-activated myofibroblasts promote metastasis of pancreatic cancer.[J] .Cancer Cell, 2023, undefined: undefined.