骨細胞線粒體通過STING依賴的抗腫瘤免疫抑制腫瘤發(fā)展
骨骼是多種癌癥的常見轉(zhuǎn)移部位，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌。癌癥一旦轉(zhuǎn)移到骨骼，幾乎無法治愈，往往會導致骨骼疾病，包括骨痛、病理性骨折、神經(jīng)壓迫綜合征，最終患者死亡。骨骼是一個高度動態(tài)的器官，它承載著多種細胞群，包括成骨細胞、破骨細胞和骨細胞。其中，骨細胞是骨中含量最豐富的細胞(>95%)，是骨代謝和穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者。然而，骨細胞對轉(zhuǎn)移性癌細胞的影響仍相對不清楚和有爭議。腫瘤產(chǎn)生的物理力導致骨細胞的生長促進前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。骨細胞連接蛋白43半通道活性抑制乳腺癌生長和骨轉(zhuǎn)移。最近的一項研究表明，骨細胞及其條件培養(yǎng)基(CM)可以通過Lrp5和β-catenin激活Wnt信號通路來抑制腫瘤進展和骨丟失。骨細胞有一個廣泛的樹突網(wǎng)絡(luò)，使其自身之間以及與骨微環(huán)境中的其他效應(yīng)細胞之間能夠直接溝通。作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體通過其樹突網(wǎng)絡(luò)在骨細胞之間轉(zhuǎn)移，以維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。除了作為細胞“動力源”的主要作用外，線粒體最近被視為生物能、生物合成和信號傳導的細胞器。越來越多的證據(jù)表明，線粒體不僅在細胞內(nèi)，而且在細胞間的信息轉(zhuǎn)導中起核心作用。細胞間線粒體轉(zhuǎn)移是一種普遍的生物事件，在生理和病理條件下均可發(fā)生。多項研究報道，線粒體在腫瘤細胞與其他細胞之間轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、治療抵抗、免疫侵襲等。作者提出骨細胞通過其樹突狀網(wǎng)絡(luò)通過細胞間線粒體轉(zhuǎn)移與骨微環(huán)境中的轉(zhuǎn)移性癌細胞進行交流。該研究發(fā)表在《Science Advances》，IF：13.6。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. 骨細胞在骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮保護作用
為了闡明骨細胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移性癌癥進展中的作用，作者建立了一種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在該模型中，出生后可以通過基于白喉毒素（DT）的細胞消融特異性靶向骨細胞。將DMP1-Cre小鼠與ROSA26-LoxP-DTR（白喉毒素受體）小鼠交配，獲得DMP1-Cre iDTR小鼠。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP1）在骨細胞和成牙本質(zhì)細胞中高表達，但在成骨細胞中不表達。給DMP1-Cre iDTR小鼠注射DT會導致骨細胞死亡，對骨小梁骨量沒有短期影響。為了評估骨細胞在轉(zhuǎn)移性腫瘤生長中的作用，作者將LLC癌細胞注射到DMP1-Cre iDTR突變小鼠及其同窩對照iDTR小鼠（圖1A）。在腫瘤植入前，小鼠注射DT以清除骨細胞。在第14天，與對照組相比，骨細胞清除小鼠的轉(zhuǎn)移性腫瘤進展增加（腫瘤體積、重量）。Micro-CT（計算機斷層掃描）分析顯示，與對照組小鼠相比，Dmp1-Cre iDTR小鼠的骨小梁體積、骨小梁數(shù)量降低，骨小梁分離增加（圖1D，E）。這些數(shù)據(jù)表明骨細胞在骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中發(fā)揮保護作用。
接下來，為了探究骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境的細胞組成，作者使用了CAG-ZsGreen小鼠模型()。在相同的骨轉(zhuǎn)移腫瘤模型中，LLC癌細胞被注射到CAG-ZsGreen小鼠腹腔內(nèi)。腫瘤細胞種植后14 d處死小鼠，切除腫瘤并消化。然后，作者通過熒光激活細胞分選從CAG-ZsGreen小鼠的脛骨腫瘤中分離出浸潤細胞，并使用液滴介導的單細胞RNA測序平臺來分析FACS純化的活腫瘤浸潤細胞。然后作者使用Seurat（STAR方法）進行細胞分類和標記基因鑒定（圖1F）。作者根據(jù)已知的細胞標志物（單核細胞/巨噬細胞、破骨細胞、中性粒細胞、T/自然殺傷細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、成骨細胞和成肌細胞），使用T分布隨機鄰近嵌入（T-SNE）方法識別并可視化了8個主要集群（圖1G）。特別是在轉(zhuǎn)移微環(huán)境中幾乎沒有出現(xiàn)骨細胞（圖1H）。為了進一步研究骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中骨細胞和癌細胞之間的相互作用，作者建立了DMP1-Cre mGmT報告小鼠。使用流式細胞術(shù)，作者觀察到類似的結(jié)果，ZsGreen+浸潤細胞占小鼠骨轉(zhuǎn)移癌的16.10±4.55%，而tdTomato+骨細胞未出現(xiàn)在腫瘤中（圖1I）。上述結(jié)果表明，骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中骨細胞不能浸潤到腫瘤球體中。
圖1 骨細胞在骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮保護作用
2. 骨轉(zhuǎn)移時骨細胞將線粒體轉(zhuǎn)移到癌細胞
接下來，作者試圖探索骨細胞如何在骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中調(diào)控癌細胞。作者之前的研究證明了骨細胞之間的樹突狀網(wǎng)絡(luò)，其中線粒體共享以維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。然后，作者向小鼠引入骨細胞特異性光激活線粒體（DMP1-PhAM），以研究骨細胞是否將線粒體轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移性癌細胞。用pLenti-CMV-mCherry-puro慢病毒感染LLC細胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達mcherry的LLC細胞（LLC- mcherry）。將LLC-mCherry細胞接種于DMP1-PhAM小鼠脛骨或髂動脈，建立骨轉(zhuǎn)移模型。14 d后處死荷瘤小鼠，分離腫瘤進行分析（圖2A）。共聚焦成像顯示，來自骨細胞的Dendra2+線粒體在兩種骨轉(zhuǎn)移模型的LLC-mCherry癌細胞中均存在（圖2B），表明線粒體從骨細胞轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移癌細胞的細胞間轉(zhuǎn)移。在骨髓中未觀察到骨細胞來源的線粒體（圖2B）。流式細胞術(shù)分析一致顯示，腫瘤中存在雙陽性細胞（mCherry +和Dendra2 +）（圖2E）。此外，作者根據(jù)scRNA-seq分析，分選和鑒定了腫瘤中接受骨細胞來源線粒體的細胞（圖2C）。利用已知的細胞類型特異性基因標志物，作者使用T-SNE方法顯示了5個簇，包括LLC-mCherry、巨噬細胞、單核細胞、T/NK細胞和成纖維細胞。所有表達mCherry序列的簇均被歸類為腫瘤細胞，這些腫瘤細胞占骨細胞來源的線粒體接受細胞的78.52%（圖2D）。
近年來，人們描述了幾種細胞間線粒體轉(zhuǎn)移的途徑，包括隧道納米管（TNTs）、縫隙連接和微囊泡。為避免供體細胞的染料滲漏，作者用噬菌體感染骨細胞系MLO-Y4。MLO-Y4-mtDendra2慢病毒，穩(wěn)定生產(chǎn)線粒體特異性dendra2標簽蛋白（MLO-Y4-mtDendra2）。共聚焦成像顯示了MLO-Y4衍生的Dendra2+線粒體在連接癌細胞和骨細胞的納米管中的共定位（圖2F）。共培養(yǎng)24 h后，作者在LLC-mCherry細胞的細胞質(zhì)中觀察到表達dendra2的線粒體（圖2G）。共聚焦切片和正交視圖也證實了LLC-mCherry細胞中存在表達dendra2的線粒體（圖2H）。此外，流式細胞術(shù)分析顯示，LLC-mCherry與MLO-Y4-mtDendra2共培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)新的雙陽性癌細胞（圖2I）。此外，作者觀察到MLO-Y4細胞中表達dendra2的線粒體向LLC-mCherry細胞動態(tài)遷移（圖2J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明在骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中，骨細胞通過TNT將線粒體轉(zhuǎn)移到癌細胞。
圖2 骨轉(zhuǎn)移時骨細胞將線粒體轉(zhuǎn)移到癌細胞
3. Miro1和MFN2調(diào)控線粒體從骨細胞轉(zhuǎn)移到癌細胞
據(jù)報道，線粒體Rho GTP酶1（Miro1）是TNT介導的細胞間線粒體轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。此外，作者之前的研究表明，MFN2參與了骨細胞樹突過程中線粒體的動態(tài)運動。為了確認MFN2和Miro1在骨細胞和癌細胞之間的細胞間線粒體轉(zhuǎn)移中的作用，作者用或特異性的短發(fā)卡RNA（shRNA）轉(zhuǎn)染MLO-Y4-mtDendra2細胞。作者觀察到，沉默或在MLO-Y4-mtDendra2細胞中降低了向LLC-mCherry細胞的細胞間線粒體轉(zhuǎn)移水平，這是在共培養(yǎng)24小時后通過流式細胞術(shù)測定的（圖3A，B）。在MLO-Y4-mtDendra2細胞過表達或在MLO-Y4-mtDendra2細胞中觀察到線粒體轉(zhuǎn)移顯著增加（圖3C，D）。
為了研究MFN2或Miro1在體內(nèi)對骨細胞和癌細胞之間線粒體轉(zhuǎn)移的影響，作者在DMP1-PhAM小鼠的背景下構(gòu)建了兩種骨細胞條條性缺失或在骨細胞中的小鼠模型。作者向8周齡的DMP1-PhAM、DMP1-PhAM和DMP1-PhAM對照小鼠腹腔內(nèi)注射LLC-mCherry。14 d后處死小鼠，切除腫瘤進行進一步分析。共聚焦成像顯示，在條條性去除或后，從骨細胞轉(zhuǎn)移到mcherry標記的LLC癌細胞的dendra2標記的線粒體顯著減少（圖3E，F）。與這些結(jié)果一致，流式細胞術(shù)分析顯示，在條條性去除或在骨細胞中，雙陽性癌細胞顯著減少（圖3G，H）。這些發(fā)現(xiàn)表明MFN2和Miro1參與介導骨細胞和癌細胞之間的線粒體轉(zhuǎn)移。
圖3 Miro1和MFN2調(diào)控線粒體從骨細胞轉(zhuǎn)移到癌細胞
4. 骨細胞線粒體抑制骨轉(zhuǎn)移癌進展
為了研究骨細胞線粒體對體內(nèi)癌細胞轉(zhuǎn)移的影響，作者將LLC癌細胞注射到8周齡的Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和同周齡的野生型對照小鼠體內(nèi)。如圖4A所示，與對照組相比，抑制來自骨細胞的線粒體轉(zhuǎn)移促進了骨轉(zhuǎn)移癌的進展（腫瘤重量、體積，圖4b）。與野生型對照相比，腫瘤相關(guān)脛骨的Micro-CT分析證實了溶骨性病變的存在，并表明在線粒體轉(zhuǎn)移受到抑制后，骨小梁體積和骨小梁數(shù)量減少（圖4C，D）。然后，作者用CMV-mCherry-Luc-殺稻菌素慢病毒感染LLC細胞，以建立穩(wěn)定表達熒光素酶的LLC細胞。將LLC-mCherry-Luc細胞注入10周齡Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和同周齡野生型對照小鼠的髂動脈，建立另一種骨轉(zhuǎn)移模型。作者在脛骨內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢，即與對照野生型小鼠相比，小鼠和小鼠的骨轉(zhuǎn)移進展增加（圖4E，F）。
此外，正如免疫印跡所示，MFN2在皮質(zhì)骨蛋白中的水平隨著年齡的增長而下降（圖4G）。作者還觀察到，與年輕（1月齡）小鼠相比，在老年（18月齡）小鼠的皮質(zhì)骨中，線粒體運輸相關(guān)基因的表達降低（圖4H）。然后，作者將LLC-mCherry植入年輕（2個月）、成熟（6個月）和老年（18個月）DMP1-PhAM小鼠的脛骨內(nèi)。轉(zhuǎn)移性腫瘤的共聚焦成像顯示，DMP1-PhAM小鼠中，隨著年齡的增長，細胞間線粒體從骨細胞轉(zhuǎn)移到癌細胞的數(shù)量持續(xù)下降（圖4I，J）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，與成熟和年輕小鼠相比，老年小鼠的脛骨內(nèi)腫瘤進展增加（腫瘤重量、體積）。作者的數(shù)據(jù)顯示，骨細胞線粒體轉(zhuǎn)移到癌細胞抑制骨微環(huán)境中的骨轉(zhuǎn)移癌癥進展。隨著年齡的增長，細胞間線粒體轉(zhuǎn)移水平降低，這可能在骨微環(huán)境中參與了骨轉(zhuǎn)移癌的進展。
圖4 骨細胞線粒體抑制骨轉(zhuǎn)移癌進展
5. 骨細胞線粒體通過cGAS增加癌細胞胞質(zhì)mtDNA并激活STING通路
線粒體DNA（mtDNA）是一種有效的損傷相關(guān)分子模式（DAMP），已被報道可激活cGAS/STING固有免疫通路。為了測試外源性線粒體是否轉(zhuǎn)移到受體細胞，并激活cGAS/STING通路，作者應(yīng)用MitoCeption人工和定量轉(zhuǎn)移線粒體到癌細胞。
作者將骨細胞線粒體移植到LLC細胞中，24小時后進行亞細胞分離。通過定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測細胞內(nèi)和細胞核中含有線粒體特異性基因和細胞核特異性基因的DNA相對水平。作者發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，線粒體移植組線粒體的細胞質(zhì)mtDNA顯著增加（圖5A）。共聚焦成像還顯示，在接受骨細胞線粒體的細胞中，線粒體外細胞質(zhì)中的雙鏈DNA信號更顯著（圖5B）。骨細胞線粒體移植到LLC細胞中導致了cGAS/STING的激活，如pSTING、pTBK1、pIRF3和下游核因子κB（NF-κB）pP65水平顯著升高所示（圖5C）。與此同時，通過MitoCeption進行線粒體轉(zhuǎn)移后，sting依賴性促炎基因的表達顯著上調(diào)（圖5D）。癌細胞中觀察到的STING通路的激活被敲低(KD)消除（圖5C，D）。此外，作者從小鼠、小鼠和野生型對照小鼠的髂內(nèi)動脈模型中分離出癌細胞，并在野生型小鼠中檢測到類似的STING依賴性促炎基因表達顯著上調(diào)的趨勢（圖5E）。這些結(jié)果表明，骨細胞線粒體可以在癌細胞中激活cGAS/STING通路。
根據(jù)以往的報道，BAX在調(diào)控線粒體釋放mtDNA中起著關(guān)鍵作用。因此，作者從KD MLO-Y4細胞中分離線粒體，并將其轉(zhuǎn)移到LLC癌細胞中。作者發(fā)現(xiàn)來自KD MLO-Y4細胞的線粒體不能增加細胞質(zhì)mtDNA癌細胞的水平（圖5F）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，在接受來自KD MLO-Y4細胞線粒體的LLC細胞的線粒體部分中，mtDNA水平顯著增加（圖5G）。這些結(jié)果表明，mtDNA從骨細胞線粒體釋放到癌細胞胞漿是依賴于BAX的。
圖5 骨細胞線粒體增加癌細胞胞質(zhì)mtDNA，并通過cGAS激活STING
6. 骨細胞線粒體可提高腫瘤免疫原性，誘導抗腫瘤免疫
最近的研究報道，癌細胞中cGAS/STING的激活導致二核苷酸cGAMP的產(chǎn)生，觸發(fā)樹突狀細胞和巨噬細胞中STING通路的激活，進而誘導CD8+ T和NK保護性抗腫瘤免疫。接下來，作者試圖探索抑制細胞間線粒體轉(zhuǎn)移后免疫微環(huán)境的變化。為了全面了解免疫微環(huán)境成分的變化，作者分離了荷瘤Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和野生型對照的腫瘤，然后進行了scRNA-seq。在分選出CD45+的免疫細胞后，作者使用T - sne方法，根據(jù)已知的細胞標志物，識別并可視化了8個主要簇：T細胞、B細胞、NK細胞、中性粒細胞、DCs、單核細胞、巨噬細胞和細胞（圖6A，B）。作者觀察到T細胞比例增加。在Dmp1Cre Mfn2?/?和Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠中，作者一致地檢測到腫瘤浸潤免疫細胞顯著減少（圖6C，E-G）。接下來，作者進行了基于9-plex珠鏈的檢測，以定量骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的炎癥介質(zhì)水平。體內(nèi)細胞間線粒體轉(zhuǎn)移受到抑制后，幾種關(guān)鍵的炎癥細胞因子（包括白細胞介素-1α（IL-1α）、IL-1β和IL-18）、生長因子和趨化因子減少（圖6I），表明骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的免疫激活較弱。根據(jù)經(jīng)典標志物，作者將髓系細胞重新聚集成12個亞組，包括大多數(shù)被鑒定為單核細胞/巨噬細胞（80%~90%）的細胞和少數(shù)（<20%）被鑒定為DCs（圖6J）。與野生型對照組相比，Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?組的DC亞組，包括常規(guī)1型DCs (cDC1)，常規(guī)2型DCs（cDC2），遷移DCs（mDCs）和漿細胞樣DCs（pDCs）的總比例均下降（圖6K和L）。通過流式細胞術(shù)分析，作者觀察到腫瘤浸潤DCs的總比例下降（圖6D和H）。DCs是一組在腫瘤微環(huán)境中刺激淋巴細胞啟動抗腫瘤反應(yīng)的特異性抗原提呈細胞。為了進一步監(jiān)測這些腫瘤浸潤DCs的活化狀態(tài)，作者發(fā)現(xiàn)在Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?組中，一系列DC成熟標志物在cDC1s中均下調(diào)（圖6M）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，抑制細胞間線粒體從骨細胞轉(zhuǎn)移到癌細胞促進骨轉(zhuǎn)移癌的進展和減少免疫浸潤，使“熱”腫瘤變成“冷”腫瘤。
圖6 骨細胞線粒體可提高腫瘤免疫原性，誘導抗腫瘤免疫
結(jié)論：
該研究提供了一個可能的視角來理解年齡誘導的骨微環(huán)境的變化如何影響癌細胞的生物學行為和癌癥患者的進一步臨床結(jié)局。未來的工作將需要研究是否調(diào)節(jié)骨細胞線粒體可能代表骨轉(zhuǎn)移治療的治療靶點。
實驗方法：
細胞培養(yǎng)，小鼠實驗，骨細胞消融，腫瘤移植，生物熒光成像，細胞轉(zhuǎn)染，線粒體分離和人工轉(zhuǎn)移，線粒體DNA分離和轉(zhuǎn)染，海馬耗氧量，亞細胞分離，DNA提取和mtDNA拷貝數(shù)分析，流式細胞術(shù)和FACS，單細胞RNA測序，原始數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制和下游分析，蛋白質(zhì)印跡分析，組織病理學，包埋染色，免疫熒光，細胞成像與分析，Micro-CT analysis，RNA提取和實時PCR
參考文獻：
Zhou H, Zhang W, Li H, Xu F, Yinwang E, Xue Y, et al. Osteocyte mitochondria inhibit tumor development via STING-dependent antitumor immunity. Sci Adv. 2024 Jan 19;10(3):eadi4298. doi: 10.1126/sciadv.adi4298.