骨細(xì)胞線粒體通過STING依賴的抗腫瘤免疫抑制腫瘤發(fā)展
骨骼是多種癌癥的常見轉(zhuǎn)移部位，包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌。癌癥一旦轉(zhuǎn)移到骨骼，幾乎無法治愈，往往會(huì)導(dǎo)致骨骼疾病，包括骨痛、病理性骨折、神經(jīng)壓迫綜合征，最終患者死亡。骨骼是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的器官，它承載著多種細(xì)胞群，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。其中，骨細(xì)胞是骨中含量最豐富的細(xì)胞(>95%)，是骨代謝和穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)者。然而，骨細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的影響仍相對(duì)不清楚和有爭議。腫瘤產(chǎn)生的物理力導(dǎo)致骨細(xì)胞的生長促進(jìn)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。骨細(xì)胞連接蛋白43半通道活性抑制乳腺癌生長和骨轉(zhuǎn)移。最近的一項(xiàng)研究表明，骨細(xì)胞及其條件培養(yǎng)基(CM)可以通過Lrp5和β-catenin激活Wnt信號(hào)通路來抑制腫瘤進(jìn)展和骨丟失。骨細(xì)胞有一個(gè)廣泛的樹突網(wǎng)絡(luò)，使其自身之間以及與骨微環(huán)境中的其他效應(yīng)細(xì)胞之間能夠直接溝通。作者之前的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體通過其樹突網(wǎng)絡(luò)在骨細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，以維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。除了作為細(xì)胞“動(dòng)力源”的主要作用外，線粒體最近被視為生物能、生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞器。越來越多的證據(jù)表明，線粒體不僅在細(xì)胞內(nèi)，而且在細(xì)胞間的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)中起核心作用。細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移是一種普遍的生物事件，在生理和病理?xiàng)l件下均可發(fā)生。多項(xiàng)研究報(bào)道，線粒體在腫瘤細(xì)胞與其他細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生、治療抵抗、免疫侵襲等。作者提出骨細(xì)胞通過其樹突狀網(wǎng)絡(luò)通過細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移與骨微環(huán)境中的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞進(jìn)行交流。該研究發(fā)表在《Science Advances》，IF：13.6。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. 骨細(xì)胞在骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮保護(hù)作用
為了闡明骨細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移性癌癥進(jìn)展中的作用，作者建立了一種轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在該模型中，出生后可以通過基于白喉毒素（DT）的細(xì)胞消融特異性靶向骨細(xì)胞。將DMP1-Cre小鼠與ROSA26-LoxP-DTR（白喉毒素受體）小鼠交配，獲得DMP1-Cre iDTR小鼠。牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP1）在骨細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，但在成骨細(xì)胞中不表達(dá)。給DMP1-Cre iDTR小鼠注射DT會(huì)導(dǎo)致骨細(xì)胞死亡，對(duì)骨小梁骨量沒有短期影響。為了評(píng)估骨細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性腫瘤生長中的作用，作者將LLC癌細(xì)胞注射到DMP1-Cre iDTR突變小鼠及其同窩對(duì)照iDTR小鼠（圖1A）。在腫瘤植入前，小鼠注射DT以清除骨細(xì)胞。在第14天，與對(duì)照組相比，骨細(xì)胞清除小鼠的轉(zhuǎn)移性腫瘤進(jìn)展增加（腫瘤體積、重量）。Micro-CT（計(jì)算機(jī)斷層掃描）分析顯示，與對(duì)照組小鼠相比，Dmp1-Cre iDTR小鼠的骨小梁體積、骨小梁數(shù)量降低，骨小梁分離增加（圖1D，E）。這些數(shù)據(jù)表明骨細(xì)胞在骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中發(fā)揮保護(hù)作用。
接下來，為了探究骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境的細(xì)胞組成，作者使用了CAG-ZsGreen小鼠模型()。在相同的骨轉(zhuǎn)移腫瘤模型中，LLC癌細(xì)胞被注射到CAG-ZsGreen小鼠腹腔內(nèi)。腫瘤細(xì)胞種植后14 d處死小鼠，切除腫瘤并消化。然后，作者通過熒光激活細(xì)胞分選從CAG-ZsGreen小鼠的脛骨腫瘤中分離出浸潤細(xì)胞，并使用液滴介導(dǎo)的單細(xì)胞RNA測序平臺(tái)來分析FACS純化的活腫瘤浸潤細(xì)胞。然后作者使用Seurat（STAR方法）進(jìn)行細(xì)胞分類和標(biāo)記基因鑒定（圖1F）。作者根據(jù)已知的細(xì)胞標(biāo)志物（單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T/自然殺傷細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞），使用T分布隨機(jī)鄰近嵌入（T-SNE）方法識(shí)別并可視化了8個(gè)主要集群（圖1G）。特別是在轉(zhuǎn)移微環(huán)境中幾乎沒有出現(xiàn)骨細(xì)胞（圖1H）。為了進(jìn)一步研究骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中骨細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的相互作用，作者建立了DMP1-Cre mGmT報(bào)告小鼠。使用流式細(xì)胞術(shù)，作者觀察到類似的結(jié)果，ZsGreen+浸潤細(xì)胞占小鼠骨轉(zhuǎn)移癌的16.10±4.55%，而tdTomato+骨細(xì)胞未出現(xiàn)在腫瘤中（圖1I）。上述結(jié)果表明，骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中骨細(xì)胞不能浸潤到腫瘤球體中。
圖1 骨細(xì)胞在骨轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮保護(hù)作用
2. 骨轉(zhuǎn)移時(shí)骨細(xì)胞將線粒體轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞
接下來，作者試圖探索骨細(xì)胞如何在骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中調(diào)控癌細(xì)胞。作者之前的研究證明了骨細(xì)胞之間的樹突狀網(wǎng)絡(luò)，其中線粒體共享以維持骨微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。然后，作者向小鼠引入骨細(xì)胞特異性光激活線粒體（DMP1-PhAM），以研究骨細(xì)胞是否將線粒體轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞。用pLenti-CMV-mCherry-puro慢病毒感染LLC細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)mcherry的LLC細(xì)胞（LLC- mcherry）。將LLC-mCherry細(xì)胞接種于DMP1-PhAM小鼠脛骨或髂動(dòng)脈，建立骨轉(zhuǎn)移模型。14 d后處死荷瘤小鼠，分離腫瘤進(jìn)行分析（圖2A）。共聚焦成像顯示，來自骨細(xì)胞的Dendra2+線粒體在兩種骨轉(zhuǎn)移模型的LLC-mCherry癌細(xì)胞中均存在（圖2B），表明線粒體從骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。在骨髓中未觀察到骨細(xì)胞來源的線粒體（圖2B）。流式細(xì)胞術(shù)分析一致顯示，腫瘤中存在雙陽性細(xì)胞（mCherry +和Dendra2 +）（圖2E）。此外，作者根據(jù)scRNA-seq分析，分選和鑒定了腫瘤中接受骨細(xì)胞來源線粒體的細(xì)胞（圖2C）。利用已知的細(xì)胞類型特異性基因標(biāo)志物，作者使用T-SNE方法顯示了5個(gè)簇，包括LLC-mCherry、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T/NK細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。所有表達(dá)mCherry序列的簇均被歸類為腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞占骨細(xì)胞來源的線粒體接受細(xì)胞的78.52%（圖2D）。
近年來，人們描述了幾種細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移的途徑，包括隧道納米管（TNTs）、縫隙連接和微囊泡。為避免供體細(xì)胞的染料滲漏，作者用噬菌體感染骨細(xì)胞系MLO-Y4。MLO-Y4-mtDendra2慢病毒，穩(wěn)定生產(chǎn)線粒體特異性dendra2標(biāo)簽蛋白（MLO-Y4-mtDendra2）。共聚焦成像顯示了MLO-Y4衍生的Dendra2+線粒體在連接癌細(xì)胞和骨細(xì)胞的納米管中的共定位（圖2F）。共培養(yǎng)24 h后，作者在LLC-mCherry細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到表達(dá)dendra2的線粒體（圖2G）。共聚焦切片和正交視圖也證實(shí)了LLC-mCherry細(xì)胞中存在表達(dá)dendra2的線粒體（圖2H）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，LLC-mCherry與MLO-Y4-mtDendra2共培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)新的雙陽性癌細(xì)胞（圖2I）。此外，作者觀察到MLO-Y4細(xì)胞中表達(dá)dendra2的線粒體向LLC-mCherry細(xì)胞動(dòng)態(tài)遷移（圖2J）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明在骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中，骨細(xì)胞通過TNT將線粒體轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞。
圖2 骨轉(zhuǎn)移時(shí)骨細(xì)胞將線粒體轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞
3. Miro1和MFN2調(diào)控線粒體從骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞
據(jù)報(bào)道，線粒體Rho GTP酶1（Miro1）是TNT介導(dǎo)的細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。此外，作者之前的研究表明，MFN2參與了骨細(xì)胞樹突過程中線粒體的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)。為了確認(rèn)MFN2和Miro1在骨細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移中的作用，作者用或特異性的短發(fā)卡RNA（shRNA）轉(zhuǎn)染MLO-Y4-mtDendra2細(xì)胞。作者觀察到，沉默或在MLO-Y4-mtDendra2細(xì)胞中降低了向LLC-mCherry細(xì)胞的細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移水平，這是在共培養(yǎng)24小時(shí)后通過流式細(xì)胞術(shù)測定的（圖3A，B）。在MLO-Y4-mtDendra2細(xì)胞過表達(dá)或在MLO-Y4-mtDendra2細(xì)胞中觀察到線粒體轉(zhuǎn)移顯著增加（圖3C，D）。
為了研究MFN2或Miro1在體內(nèi)對(duì)骨細(xì)胞和癌細(xì)胞之間線粒體轉(zhuǎn)移的影響，作者在DMP1-PhAM小鼠的背景下構(gòu)建了兩種骨細(xì)胞條條性缺失或在骨細(xì)胞中的小鼠模型。作者向8周齡的DMP1-PhAM、DMP1-PhAM和DMP1-PhAM對(duì)照小鼠腹腔內(nèi)注射LLC-mCherry。14 d后處死小鼠，切除腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步分析。共聚焦成像顯示，在條條性去除或后，從骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到mcherry標(biāo)記的LLC癌細(xì)胞的dendra2標(biāo)記的線粒體顯著減少（圖3E，F）。與這些結(jié)果一致，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在條條性去除或在骨細(xì)胞中，雙陽性癌細(xì)胞顯著減少（圖3G，H）。這些發(fā)現(xiàn)表明MFN2和Miro1參與介導(dǎo)骨細(xì)胞和癌細(xì)胞之間的線粒體轉(zhuǎn)移。
圖3 Miro1和MFN2調(diào)控線粒體從骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞
4. 骨細(xì)胞線粒體抑制骨轉(zhuǎn)移癌進(jìn)展
為了研究骨細(xì)胞線粒體對(duì)體內(nèi)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，作者將LLC癌細(xì)胞注射到8周齡的Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和同周齡的野生型對(duì)照小鼠體內(nèi)。如圖4A所示，與對(duì)照組相比，抑制來自骨細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)移促進(jìn)了骨轉(zhuǎn)移癌的進(jìn)展（腫瘤重量、體積，圖4b）。與野生型對(duì)照相比，腫瘤相關(guān)脛骨的Micro-CT分析證實(shí)了溶骨性病變的存在，并表明在線粒體轉(zhuǎn)移受到抑制后，骨小梁體積和骨小梁數(shù)量減少（圖4C，D）。然后，作者用CMV-mCherry-Luc-殺稻菌素慢病毒感染LLC細(xì)胞，以建立穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的LLC細(xì)胞。將LLC-mCherry-Luc細(xì)胞注入10周齡Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和同周齡野生型對(duì)照小鼠的髂動(dòng)脈，建立另一種骨轉(zhuǎn)移模型。作者在脛骨內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢(shì)，即與對(duì)照野生型小鼠相比，小鼠和小鼠的骨轉(zhuǎn)移進(jìn)展增加（圖4E，F）。
此外，正如免疫印跡所示，MFN2在皮質(zhì)骨蛋白中的水平隨著年齡的增長而下降（圖4G）。作者還觀察到，與年輕（1月齡）小鼠相比，在老年（18月齡）小鼠的皮質(zhì)骨中，線粒體運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)降低（圖4H）。然后，作者將LLC-mCherry植入年輕（2個(gè)月）、成熟（6個(gè)月）和老年（18個(gè)月）DMP1-PhAM小鼠的脛骨內(nèi)。轉(zhuǎn)移性腫瘤的共聚焦成像顯示，DMP1-PhAM小鼠中，隨著年齡的增長，細(xì)胞間線粒體從骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞的數(shù)量持續(xù)下降（圖4I，J）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，與成熟和年輕小鼠相比，老年小鼠的脛骨內(nèi)腫瘤進(jìn)展增加（腫瘤重量、體積）。作者的數(shù)據(jù)顯示，骨細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞抑制骨微環(huán)境中的骨轉(zhuǎn)移癌癥進(jìn)展。隨著年齡的增長，細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移水平降低，這可能在骨微環(huán)境中參與了骨轉(zhuǎn)移癌的進(jìn)展。
圖4 骨細(xì)胞線粒體抑制骨轉(zhuǎn)移癌進(jìn)展
5. 骨細(xì)胞線粒體通過cGAS增加癌細(xì)胞胞質(zhì)mtDNA并激活STING通路
線粒體DNA（mtDNA）是一種有效的損傷相關(guān)分子模式（DAMP），已被報(bào)道可激活cGAS/STING固有免疫通路。為了測試外源性線粒體是否轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并激活cGAS/STING通路，作者應(yīng)用MitoCeption人工和定量轉(zhuǎn)移線粒體到癌細(xì)胞。
作者將骨細(xì)胞線粒體移植到LLC細(xì)胞中，24小時(shí)后進(jìn)行亞細(xì)胞分離。通過定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核中含有線粒體特異性基因和細(xì)胞核特異性基因的DNA相對(duì)水平。作者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，線粒體移植組線粒體的細(xì)胞質(zhì)mtDNA顯著增加（圖5A）。共聚焦成像還顯示，在接受骨細(xì)胞線粒體的細(xì)胞中，線粒體外細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈DNA信號(hào)更顯著（圖5B）。骨細(xì)胞線粒體移植到LLC細(xì)胞中導(dǎo)致了cGAS/STING的激活，如pSTING、pTBK1、pIRF3和下游核因子κB（NF-κB）pP65水平顯著升高所示（圖5C）。與此同時(shí)，通過MitoCeption進(jìn)行線粒體轉(zhuǎn)移后，sting依賴性促炎基因的表達(dá)顯著上調(diào)（圖5D）。癌細(xì)胞中觀察到的STING通路的激活被敲低(KD)消除（圖5C，D）。此外，作者從小鼠、小鼠和野生型對(duì)照小鼠的髂內(nèi)動(dòng)脈模型中分離出癌細(xì)胞，并在野生型小鼠中檢測到類似的STING依賴性促炎基因表達(dá)顯著上調(diào)的趨勢(shì)（圖5E）。這些結(jié)果表明，骨細(xì)胞線粒體可以在癌細(xì)胞中激活cGAS/STING通路。
根據(jù)以往的報(bào)道，BAX在調(diào)控線粒體釋放mtDNA中起著關(guān)鍵作用。因此，作者從KD MLO-Y4細(xì)胞中分離線粒體，并將其轉(zhuǎn)移到LLC癌細(xì)胞中。作者發(fā)現(xiàn)來自KD MLO-Y4細(xì)胞的線粒體不能增加細(xì)胞質(zhì)mtDNA癌細(xì)胞的水平（圖5F）。此外，作者發(fā)現(xiàn)，在接受來自KD MLO-Y4細(xì)胞線粒體的LLC細(xì)胞的線粒體部分中，mtDNA水平顯著增加（圖5G）。這些結(jié)果表明，mtDNA從骨細(xì)胞線粒體釋放到癌細(xì)胞胞漿是依賴于BAX的。
圖5 骨細(xì)胞線粒體增加癌細(xì)胞胞質(zhì)mtDNA，并通過cGAS激活STING
6. 骨細(xì)胞線粒體可提高腫瘤免疫原性，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫
最近的研究報(bào)道，癌細(xì)胞中cGAS/STING的激活導(dǎo)致二核苷酸cGAMP的產(chǎn)生，觸發(fā)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中STING通路的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)CD8+ T和NK保護(hù)性抗腫瘤免疫。接下來，作者試圖探索抑制細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移后免疫微環(huán)境的變化。為了全面了解免疫微環(huán)境成分的變化，作者分離了荷瘤Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠和野生型對(duì)照的腫瘤，然后進(jìn)行了scRNA-seq。在分選出CD45+的免疫細(xì)胞后，作者使用T - sne方法，根據(jù)已知的細(xì)胞標(biāo)志物，識(shí)別并可視化了8個(gè)主要簇：T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、DCs、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞（圖6A，B）。作者觀察到T細(xì)胞比例增加。在Dmp1Cre Mfn2?/?和Dmp1Cre Rhot1?/?小鼠中，作者一致地檢測到腫瘤浸潤免疫細(xì)胞顯著減少（圖6C，E-G）。接下來，作者進(jìn)行了基于9-plex珠鏈的檢測，以定量骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的炎癥介質(zhì)水平。體內(nèi)細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移受到抑制后，幾種關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞因子（包括白細(xì)胞介素-1α（IL-1α）、IL-1β和IL-18）、生長因子和趨化因子減少（圖6I），表明骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中的免疫激活較弱。根據(jù)經(jīng)典標(biāo)志物，作者將髓系細(xì)胞重新聚集成12個(gè)亞組，包括大多數(shù)被鑒定為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（80%~90%）的細(xì)胞和少數(shù)（<20%）被鑒定為DCs（圖6J）。與野生型對(duì)照組相比，Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?組的DC亞組，包括常規(guī)1型DCs (cDC1)，常規(guī)2型DCs（cDC2），遷移DCs（mDCs）和漿細(xì)胞樣DCs（pDCs）的總比例均下降（圖6K和L）。通過流式細(xì)胞術(shù)分析，作者觀察到腫瘤浸潤DCs的總比例下降（圖6D和H）。DCs是一組在腫瘤微環(huán)境中刺激淋巴細(xì)胞啟動(dòng)抗腫瘤反應(yīng)的特異性抗原提呈細(xì)胞。為了進(jìn)一步監(jiān)測這些腫瘤浸潤DCs的活化狀態(tài)，作者發(fā)現(xiàn)在Dmp1Cre Mfn2?/?、Dmp1Cre Rhot1?/?組中，一系列DC成熟標(biāo)志物在cDC1s中均下調(diào)（圖6M）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，抑制細(xì)胞間線粒體從骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移癌的進(jìn)展和減少免疫浸潤，使“熱”腫瘤變成“冷”腫瘤。
圖6 骨細(xì)胞線粒體可提高腫瘤免疫原性，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫
結(jié)論：
該研究提供了一個(gè)可能的視角來理解年齡誘導(dǎo)的骨微環(huán)境的變化如何影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和癌癥患者的進(jìn)一步臨床結(jié)局。未來的工作將需要研究是否調(diào)節(jié)骨細(xì)胞線粒體可能代表骨轉(zhuǎn)移治療的治療靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法：
細(xì)胞培養(yǎng)，小鼠實(shí)驗(yàn)，骨細(xì)胞消融，腫瘤移植，生物熒光成像，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，線粒體分離和人工轉(zhuǎn)移，線粒體DNA分離和轉(zhuǎn)染，海馬耗氧量，亞細(xì)胞分離，DNA提取和mtDNA拷貝數(shù)分析，流式細(xì)胞術(shù)和FACS，單細(xì)胞RNA測序，原始數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制和下游分析，蛋白質(zhì)印跡分析，組織病理學(xué)，包埋染色，免疫熒光，細(xì)胞成像與分析，Micro-CT analysis，RNA提取和實(shí)時(shí)PCR
參考文獻(xiàn)：
Zhou H, Zhang W, Li H, Xu F, Yinwang E, Xue Y, et al. Osteocyte mitochondria inhibit tumor development via STING-dependent antitumor immunity. Sci Adv. 2024 Jan 19;10(3):eadi4298. doi: 10.1126/sciadv.adi4298.