單核RNA測(cè)序揭示宮頸鱗狀細(xì)胞癌和腺癌之間的異質(zhì)性

         宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）和腺癌（CAde）是宮頸癌（CC）的兩種主要病理類型，但其腫瘤和免疫微環(huán)境的高分辨率異質(zhì)性仍然難以捉摸。在這里，作者對(duì)5個(gè)CSCC和3個(gè)CAde樣本進(jìn)行單核RNA測(cè)序（snRNA-seq），并系統(tǒng)地概述了它們的特異性轉(zhuǎn)錄組圖譜。作者發(fā)現(xiàn)，與CAde中的細(xì)胞相比，CSCC中的CD8+T細(xì)胞更具細(xì)胞毒性，但T耗竭更低，并且吞噬作用的MRC1+巨噬細(xì)胞在CSCC中特異性富集。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)促腫瘤相關(guān)的肌成纖維（myoCAF）和癌癥相關(guān)的血管成纖維（vCAF）在CSCC中更豐富，并進(jìn)一步驗(yàn)證了它們?cè)隗w外的促腫瘤作用。此外，作者還通過揭示惡性上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜的異質(zhì)性，鑒定了一些針對(duì)CSCC的特異性化療藥物（達(dá)沙替尼和達(dá)馬莫德）和CAde（乙嘧啶和拉帕替尼），并進(jìn)一步驗(yàn)證了它們?cè)诩?xì)胞系和構(gòu)建的CC衍生類器官中的特異敏感性。細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)顯示，NRG1-ERBB2和FN1-ITAG3的通路分別對(duì)CAde和CSCC具有特異性，這可能部分解釋了已鑒定化療藥物的特異性。作者的研究描述了CSCC和CAde之間的免疫異質(zhì)性和特定的細(xì)胞相互作用，這為揭示發(fā)病機(jī)制和設(shè)計(jì)個(gè)性化治療提供見解。該研究于2023年10月發(fā)表在《eBioMedicine》，IF 11.1分。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. CSCC和CAde的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組景觀

         為闡明CSCC和CADE之間腫瘤間和腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，作者對(duì)五個(gè)CSCC樣本（p8、p21、p48、p53、p54）和三個(gè)CADE樣本進(jìn)行snRNA序列（圖1A）。經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和過濾，總共收集了82719個(gè)單細(xì)胞，平均每個(gè)細(xì)胞捕獲1854個(gè)基因。所有這些單細(xì)胞被注釋為九個(gè)主要細(xì)胞群：上皮細(xì)胞（CDKN2A、CDH1、EPCAM、MUC5B、WFC2和PTPRT）、間充質(zhì)細(xì)胞（COL1A1、LAMA2和ACTA2）、T細(xì)胞（CD247、CD2、CD3E）、髓系細(xì)胞（MSR1和HLA-DPB1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞（EGFL7和EMCN）、血漿細(xì)胞（IGKC和MZB1）、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（CCL21和Prox1）、B細(xì)胞（MS4A1）和母細(xì)胞（KIT和CPA3）（圖1B）。上皮細(xì)胞是CSCC和CADE樣本中最豐富的細(xì)胞類型。不同個(gè)體中九種細(xì)胞類型的分?jǐn)?shù)變化很大，表明CC中個(gè)體間異質(zhì)性巨大（圖1d和e）。

         為進(jìn)一步探索CSCC和CAde之間上皮細(xì)胞的異質(zhì)性，作者首先將上皮細(xì)胞分為21個(gè)不同的簇。作者測(cè)量了每個(gè)上皮細(xì)胞簇與參考細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞）相比的相對(duì)CNV評(píng)分，簇1/5/6/7/8/9/12/14/17/19與參考細(xì)胞相比具有更高的CNV評(píng)分，因此他們被歸類為惡性上皮細(xì)胞（圖1f和g）。作者還測(cè)量了每種細(xì)胞類型的細(xì)胞周期狀態(tài)，并觀察到癌癥細(xì)胞顯示出最低的G1期百分比，這表明大多數(shù)癌癥細(xì)胞在DNA復(fù)制中更活躍（圖1h）。

圖1：宮頸鱗狀細(xì)胞癌和腺癌單細(xì)胞表達(dá)圖譜的構(gòu)建

2. CSCC和CAde中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞群比例和功能不同

         T細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的主要組成部分，在抗腫瘤中起著關(guān)鍵作用，作者旨在進(jìn)一步剖析CSCC和CAde之間T細(xì)胞亞群和功能狀態(tài)的異質(zhì)性。根據(jù)其標(biāo)記基因?qū)?span>T細(xì)胞進(jìn)一步分為七個(gè)簇，即T_CD8+（CD8A和CD8B）、T_naive（TCF7、IL7R和CCR7），T_reg（IKZF2、IL2RA和FOXP3）、T_ex（PDCD1和LAG3）、T_nk（GNLY和NCAM1）、T_eff（NKG7、CX3CR1和FCGR3A）、T_prolif（CENPF、MKI67和TPO2A）（圖2a-c）?？偟膩碚f，T_CD8+和T_naive在CSCC和CAde中豐富。雖然P值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但CSCC中T_reg的比例似乎更高，CAde中T_ex的比例更高（圖2d）。作者還測(cè)量了每個(gè)簇的細(xì)胞毒性/耗竭/treg評(píng)分，以評(píng)估T細(xì)胞的功能狀態(tài)，其中T_eff、T_ex和T_reg分別獲得最高的細(xì)胞毒性、耗竭和treg評(píng)分（圖2e）。然后進(jìn)一步比較了這兩種病理類型在細(xì)胞毒性和衰竭功能方面的差異。如圖2f所示，與CAde相比，CSCC獲得更高的細(xì)胞毒性評(píng)分，但消耗評(píng)分較低。TCGA隊(duì)列中的CSCC患者也被證實(shí)與CAde患者相比具有更高的細(xì)胞毒性評(píng)分（圖2g），并且在TCGA數(shù)據(jù)庫中的所有CC隊(duì)列（Log-rank P=0.00283，Log-rank檢驗(yàn)）、CSCC隊(duì)列（Log-lank P=0.0026，Log-rak檢驗(yàn)）中具有更高細(xì)胞毒性評(píng)分的患者有更好的預(yù)后（圖2h）。

         髓細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中也發(fā)揮著重要作用。在該研究中，共有6267個(gè)髓系細(xì)胞根據(jù)其標(biāo)記基因重新聚類為14個(gè)亞簇，包括7個(gè)巨噬細(xì)胞（Macro-C1:PPARG；Macro-C2:SELENOP和MRC1；Macro-C3:SH3BP5；Macro-C5:GBP5；Macro-C6:VCAN和FCN1；Macro-C7:SP1）、5個(gè)樹突細(xì)胞（DC-C1:CD1A；DC-C2:LAMP3和CCR7；DC-C3:CLEC9A；DC-C4:BACH2；DC-C5:LILRA4）、1個(gè)循環(huán)細(xì)胞（TOP2A和MKI67），和未知亞型（圖2i）。每個(gè)樣品中七個(gè)巨噬細(xì)胞亞簇的組分變化很大（圖2j）。功能富集分析顯示，Macro-C1參與脂質(zhì)分解代謝過程和固醇或膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬作用和炎癥因子方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Macro-C4主要與蛋白質(zhì)定位和細(xì)胞-細(xì)胞粘附有關(guān)。其他集群具有一些共同的功能特征，例如白細(xì)胞和T細(xì)胞激活。然而，抗原處理和呈遞的相關(guān)途徑在Macro-C2中顯著富集，這是吞噬作用隨后的反應(yīng)，其在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖2k）。為進(jìn)一步剖析已鑒定巨噬細(xì)胞簇的異質(zhì)性，根據(jù)已知的基因marker測(cè)試了他們的功能評(píng)分。如圖2l所示，所有這些巨噬細(xì)胞簇都不能根據(jù)M1、M2、吞噬作用、血管生成以及骨髓來源的抑制細(xì)胞（MDSC）的評(píng)分很好地分離。值得注意的是，Macro-C2的吞噬作用得分最高，這與其抗原處理和呈遞的特定功能一致。此外，與CAde相比，CSCC獲得更高的吞噬作用得分（圖2m）。作者進(jìn)一步在收集的樣本中驗(yàn)證，與CAde相比，Macro-C2（MRC1+/CD68+）在CSCC中的含量明顯更高。

         總之，這兩種病理亞型的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞群的不同組分和功能狀態(tài)反映了它們對(duì)CC的特異性免疫反應(yīng)，這可能為免疫治療提供見解。

圖2：CSCC和CAde中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的特征和功能狀態(tài)

3. 與CAde相比，促腫瘤的vCAFs在CSCC中占主導(dǎo)地位

         作者進(jìn)一步對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行重新聚類，并鑒定了四種主要的細(xì)胞類型，包括12種成纖維細(xì)胞亞型（COL1A1和COL1A2）、兩種平滑肌細(xì)胞亞類型（ACTA2、ACTG2和MYH11）、三種周細(xì)胞亞型（NOTCH3和RGS5）和另一種未定義的成纖維細(xì)胞（PTPRC和MUC16）（圖3a-c）。為了根據(jù)通路激活和基因表達(dá)譜進(jìn)一步研究成纖維細(xì)胞的不同功能表型，使用分級(jí)聚類將12簇成纖維細(xì)胞分為四種主要表型（圖3d）。在這些亞型中，由Fib-C1/C10/C11/C12簇組成的ITGA1+成纖維細(xì)胞被定義為具有高表達(dá)ITGA1、POSTN、MMP11、FN1、FAP、COL1A1和COL8A1。 ADAMTS19+成纖維細(xì)胞由具有高表達(dá)ADAMTS19、NCAM1和COL14A1的Fib-C2/C3組成。LMCD1+成纖維細(xì)胞由高表達(dá)LMCD1、EPAS1、VEGFA、COL4A1和SOD2的Fib-C4/C5組成。PAMR1+成纖維細(xì)胞由具有高表達(dá)PTCH1和DACH1的Fib-C6/C7/C8/C9組成（圖3e）。根據(jù)已報(bào)道的成纖維細(xì)胞分類，GO注釋顯示，PAMR1+成纖維細(xì)胞參與器官發(fā)育和細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)，即發(fā)育CAFs（dCAFs）。LMCD1+成纖維細(xì)胞涉及VEGFA-VEGFR2信號(hào)通路、傷口愈合、管形態(tài)發(fā)生、MAPK和PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，進(jìn)一步定義為vCAFs。ADAMTS19+成纖維細(xì)胞主要參與NABA CORE MATERISOME和ECM組織，被定義為基質(zhì)CAFs（mCAFs）。 myoCAF主要介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組織的途徑，MET促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（圖3f）。

         接下來，使用monocle2來推斷成纖維細(xì)胞的潛在發(fā)育軌跡。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)mCAFs和dCAF主要位于發(fā)育軌跡的起點(diǎn)，而myoCAF和vCAFs分別位于兩個(gè)分支（圖3h）。在CSCC和CAde中觀察到成纖維細(xì)胞的相同發(fā)育軌跡（圖3i）。此外，在發(fā)育過程中，基因表達(dá)譜進(jìn)一步聚類為三個(gè)不同的聚類，進(jìn)一步的功能富集分析表明，癌癥相關(guān)通路（包括MAPK信號(hào)通路和胰島素受體信號(hào)通路）在vCAFs轉(zhuǎn)變過程中是活躍的。而ECM組織、結(jié)締組織發(fā)育和膠原代謝過程在myoCAF過渡過程中是活躍的（圖3j）。為進(jìn)一步探索偽時(shí)間的調(diào)節(jié)機(jī)制，鑒定了異?；钴S的TF。一些轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（如BACH2、TWIST2、CREB5和CUX1）和促血管生成轉(zhuǎn)錄因子（FOXO1、BACH1）參與vCAFs的發(fā)育過程，而ETV6和STAT2參與myoCAFs的發(fā)育進(jìn)程（圖3k）。

圖3：CSCC和CAde中間充質(zhì)細(xì)胞的特性和亞簇

         然后，作者使用TCGA隊(duì)列測(cè)量已確定的成纖維細(xì)胞亞型的預(yù)后意義。在TCGA數(shù)據(jù)庫中的所有CC隊(duì)列、CSCC隊(duì)列中，myoCAF與患者總生存率呈負(fù)相關(guān)（圖4a）。在TCGA數(shù)據(jù)庫中的所有CC隊(duì)列中，vCAFs也與患者總生存率呈負(fù)相關(guān)（圖4a）。作者進(jìn)一步驗(yàn)證了與使用mIF外部樣本的CAde相比，vCAFs和myoCAFs在CSCC中更豐富（圖4b和c）。然后，作者從一個(gè)收集的CC樣品（患者#46）中提取并培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)原代myoCAFs（POSTN+/COL1A1+）和vCAFs（SOD2+/COL1A1+1）進(jìn)行分類，并通過免疫熒光染色進(jìn)一步驗(yàn)證它們（圖4d）。Transwell分析顯示，myoCAFs和vCAFs的條件培養(yǎng)基（CM）都可以顯著促進(jìn)CC細(xì)胞的遷移能力（圖4e和f）。與myoCAFs或?qū)φ战M的CM相比，vCAFs的CM似乎顯示出更高的促進(jìn)血管生成能力（圖4g）。

         此外，vCAFs中TGFB1和VEGFA的表達(dá)水平顯著高于myoCAFs，這被證明可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和血管生成（圖4h）?？傊?，該研究結(jié)果證實(shí)，CC樣品中的原代vCAFs和myoCAF在體外顯示出促轉(zhuǎn)移的潛力。

圖4：已鑒定的腫瘤前成纖維細(xì)胞的功能驗(yàn)證

4. CSCC和CAde的不同惡性上皮亞型及其差異表達(dá)基因

         為更好地揭示CSCC和CAde的特定腫瘤內(nèi)在特征，作者將所有惡性上皮細(xì)胞重新劃分為11個(gè)簇，并鑒定了它們的標(biāo)記基因（圖5a-c）。有趣的是，基于GSVA分析，來源于CSCC和CAde的惡性上皮亞群可以很好地分離（圖5d）。值得注意的是，AKT、MTOR和ERBB2的相關(guān)通路在CAde樣本中是活躍的，而HINATA_NFKB_IMMU-INF在CSCC樣本中是活躍的。這些發(fā)現(xiàn)表明CSCC和CAde之間具有不同的內(nèi)在功能，這有助于揭示CSCC和CAde患者的不同發(fā)病機(jī)制和選擇敏感的靶向藥物。

         癌癥干性已被證明通過排出T細(xì)胞來影響一系列人類癌癥的免疫抑制。作者測(cè)量了每個(gè)簇的干性評(píng)分，發(fā)現(xiàn)與CSCC相比，CAde獲得更高的腫瘤干性，這表明CAde具有更具抑制性的免疫微環(huán)境（圖5e）?；诖耍髡咧荚跇?gòu)建一個(gè)能夠區(qū)分CSCC和CAde的基因面板。在重置閾值（|Log2FC|>1，P<0.05，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）后，建立了包含14個(gè)預(yù)后相關(guān)基因的基因集（圖5f）。為了評(píng)估建立的判別基因組的準(zhǔn)確性，作者在組織微陣列上進(jìn)行了IHC染色。如圖5g和h所示，證實(shí)MTSS1在CSCC樣品中過表達(dá)，而POLA1在CAde樣品中上調(diào)。ROC曲線證實(shí)，該基因組在CAde和CSCC分類方面表現(xiàn)出良好的性能（圖5i）。

5. 靶向CSCC和CAde的化療藥物的鑒定

         結(jié)合已鑒定的DEG，使用SCENIC算法進(jìn)一步剖析上游調(diào)控分子（即TF）的異質(zhì)性。如圖5j所示，針對(duì)CSCC鑒定了一系列特異性TF（HOXD8、ETS1、RXRA、MAFB、TBX6、IKZF1、STAT2、STAT1、MAF、SMAD3、GRHL3、TP63和HOXD10）和CAde（TEAD1、HNF4A、RFX2、XBP1、CREB3L1和HNF4G）。作者進(jìn)一步測(cè)量了它們?cè)?span>CSCC（SiHa、CaSki和ME-180）和CAde（HeLa）細(xì)胞系以及TCGA隊(duì)列中的表達(dá)（圖5k）。TF基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明，CAde的過表達(dá)基因主要受CAde特異性TF的調(diào)控，在CSCC中反之亦然（圖5l）。然后，使用Beyondcell算法基于惡性細(xì)胞的表達(dá)譜來預(yù)測(cè)藥物敏感性（圖5m）。作者隨機(jī)選擇了一些藥物，以進(jìn)一步驗(yàn)證藥物篩選的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。如圖5n所示， CAde特異性藥物（二氫葉酸還原酶抑制劑：嘧啶胺；ERBB2抑制劑：拉帕替尼）在HeLa中的IC50值比在CaSki中的小。相反，CSCC特異性藥物（STAT5抑制劑：達(dá)沙替尼；MAPK抑制劑：多馬匹莫德）在CaSki中具有更好的細(xì)胞毒性功能。作者還從臨床CSCC和CAde樣本中構(gòu)建了類器官，以更好地測(cè)試藥物敏感性，結(jié)果與CC細(xì)胞系中的結(jié)果基本一致（圖5o和p）。這些發(fā)現(xiàn)表明作者鑒定的藥物具有很強(qiáng)的可靠性，值得未來進(jìn)一步探索。

         總之，作者區(qū)分了CC的兩種亞型之間的特定惡性上皮亞群，并基于它們的DEG建立了一個(gè)判別基因組。此外，作者預(yù)測(cè)并證實(shí)了對(duì)CSCC和Cade敏感的特異性藥物，這可以為臨床實(shí)踐中探索兩種病理性CC的個(gè)體化治療提供見解。

圖5：CSCC和CAde中惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性

6. 癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞在CSCC和CAde中的特異性細(xì)胞相互作用

         為研究CSCC和CAde之間細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的異質(zhì)性，使用CellphoneDB數(shù)據(jù)庫中的一組配體-受體（L-R）對(duì)來預(yù)測(cè)九種已鑒定的主要細(xì)胞類型之間的潛在相互作用。與CSCC相比，CAde具有更豐富的相互作用對(duì)，尤其是在上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中（圖6a-c）。然后鑒定了屬于CSCC和CAde的特異性配體-受體對(duì)。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)CAde中的特異性配體-受體對(duì)比CSCC中的多（圖6d）。約68.5%的顯著相互作用對(duì)由CAde和CSCC共享，而23.5%的相互作用對(duì)是CAde特異性的。此外，在CSCC和CAde中，上皮細(xì)胞主導(dǎo)了來自間充質(zhì)細(xì)胞的特異性信號(hào)傳導(dǎo)，這是作者以下分析的主要重點(diǎn)（圖6e）。進(jìn)一步的CellChat分析顯示，癌癥細(xì)胞和已鑒定的CAF（NRG1-ERBB2/4和FN1-CD44/ITGAV/ITGA3/ITGB6/ITGB8/ITGB1）之間的信號(hào)通路分別在CAde和CSCC中特異性富集（圖6f）。值得注意的是，一些受體（ERBB2、ITGA3和ITGB6）主要在癌癥細(xì)胞中表達(dá)，其假定的配體（NRG1和FN1）在CAF中過表達(dá)（圖6g）。此外，NRG1-ERBB2和FN1-ITGA3的相互依賴的配體-受體對(duì)分別在CAde和CSCC的細(xì)胞成分中表現(xiàn)出顯著表達(dá)（圖6h和i）。

         有趣的是，已鑒定的拉帕替尼是一種ERBB2抑制劑，對(duì)CAde樣品特別敏感。先前的研究已經(jīng)證明，STAT5和MAPK是惡性腫瘤中整合素的關(guān)鍵下游分子，作者發(fā)現(xiàn)靶向STAT5和MAPK分子的達(dá)沙替尼和Doramapimod對(duì)癌癥細(xì)胞系和CSCC的類器官顯示出特異性敏感性?？偟膩碚f，作者確定了CAFs和癌癥細(xì)胞之間CSCC（FN1-ITGA3）和CAde（NRG1-ERBB2）的特異性細(xì)胞相互作用，這也可以為這兩種不同CC類型選擇有前景的治療性化療藥物提供見解。

圖6：CSCC和CAde中惡性細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的特異性通訊模式

結(jié)論：

         在這里，我們描述了單細(xì)胞溶液中五個(gè)CSCC和三個(gè)CAde樣本的不同轉(zhuǎn)錄組圖譜。這兩種病理類型之間關(guān)于上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性已經(jīng)得到了很好的證明，一些有趣的發(fā)現(xiàn)（例如，特異性化療藥物、鑒定的LECs、鑒定的myoAF或vCAFs）通過mIF染色、提取原代CAFs、構(gòu)建CC類器官等得到了進(jìn)一步驗(yàn)證（圖7）。與之前通過單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)?span>CC進(jìn)行的研究相比，我們的研究為揭示CSCC和CAde之間致癌作用和腫瘤微環(huán)境的巨大異質(zhì)性，以及為未來設(shè)計(jì)個(gè)性化治療策略提供了寶貴的資源。

參考文獻(xiàn)：

         Lin S, Sun Y, Cao C, Zhu Z, Xu Y, Liu B, Hu B, Peng T, Zhi W, Xu M, Ding W, Ren F, Ma D, Li G, Wu P. Single-nucleus RNA sequencing reveals heterogenous microenvironments and specific drug response between cervical squamous cell carcinoma and adenocarcinoma. EBioMedicine. 2023 Nov;97:104846. doi: 10.1016/j.ebiom.2023.104846. Epub 2023 Oct 24. PMID: 37879219; PMCID: PMC10618708.