通過體外轉(zhuǎn)錄的mRNA挽救p53功能阻礙高級別漿液性卵巢癌的生長

高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）是最致命的婦科惡性腫瘤。它與腫瘤間質(zhì)密切相互作用，生長迅速，廣泛轉(zhuǎn)移，并表現(xiàn)出侵襲性的過程。卵巢癌（OC）細胞停留在腹膜腔內(nèi)，僅播散到間皮襯里表面。目前的標準治療包括細胞減瘤手術(shù)和化療。然而，大約70%的患者在手術(shù)和鉑類化療后3年內(nèi)復發(fā)，并死于疾病進展。

腫瘤蛋白p53（TP53）基因是人類最常發(fā)生突變的腫瘤抑制基因，多數(shù)通過點突變，即氨基酸替換導致腫瘤蛋白p53與DNA的結(jié)合中斷。因此，p53通過對抗細胞應激和DNA損傷來保護人類基因組。許多研究表明，腫瘤細胞含有功能失活的p53，其作用機制涉及DNA損傷，從而導致野生型（WT）p53的激活，因此腫瘤細胞對化療藥物具有耐藥性。癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡揭示，高達96%的HGSOC病例具有失活或截短的TP53。此外，TP53突變似乎是腫瘤發(fā)生的早期事件，可能在OC的前體病變中，支持TP53突變作為這種惡性腫瘤的驅(qū)動因素的重要性。目前已經(jīng)開發(fā)了一些小分子來對抗p53功能的喪失，主要是通過穩(wěn)定p53的天然構(gòu)象，如PRIMA-1，它可以重新激活突變的p53，誘導癌細胞凋亡，目前正在臨床試驗中。然而，不同的研究提供了與用于p53再激活的小分子相關的脫靶效應的證據(jù)。因此，是否脫靶活動或p53功能的恢復是治療反應的起源目前正在研究中。該研究發(fā)表在《Cancer Communications》，IF：16.2。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. HGSOC細胞中基于mRNA的p53再激活誘導細胞周期停滯和細胞死亡

作者的目的是通過用p53 mRNA轉(zhuǎn)染HGSOC細胞系和原代細胞來挽救不同臨床前模型中p53的功能。在OVCAR-8細胞中，低量的p53-mRNA（10-250 ng）強烈誘導p53蛋白表達（圖1A）。與對照組相比，在轉(zhuǎn)染后24小時，在100~500 ng p53 mRNA時，G1期細胞增加（圖1B），支持p53活性的再激活。在低劑量的p53 mRNA（≥0.1μg）下，細胞周期抑制因子p21，p16和p27的強烈誘導與關鍵調(diào)節(jié)因子（如PLK1，Aurora A，CDK1和Cyclin A/B）的下調(diào)相平行，使用基于載體的p53重表達證實了作者的結(jié)果（圖1C）。這些觀察結(jié)果與0.5μg劑量的細胞活力在48小時后顯著下降約2倍相關（圖1D），與未處理對照相比，伴隨著不同細胞死亡指標的上升，如Puma，Noxa和Fas，裂解的PARP，裂解的Caspase-3（圖1C），以及Caspase 3/7活性的增加（圖1E）和膜聯(lián)蛋白染色（圖1F）。克隆形成能力的喪失是通過增加p53-mRNA的濃度來誘導的（圖1G）。作者還進行了細胞毒性試驗，該試驗證實了之前通過凋亡和集落形成試驗觀察到的IVT P53 mRNA對卵巢癌細胞的影響（圖1H）。總之，作者的觀察表明，在不同的HGSOC細胞系中，通過轉(zhuǎn)染野生型p53 mRNA來挽救p53功能會誘導細胞死亡。

圖1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄的WT p53 mRNA在HGSOC細胞系OVCAR-8中誘導細胞周期阻滯和凋亡

2. 在HGSOC細胞系OVCAR-8中，恢復p53可降低染色體不穩(wěn)定性

染色體不穩(wěn)定性是OC的基本特征，并且大多數(shù)人OC細胞表現(xiàn)出非整倍體。OVCAR-8細胞系是一種超二倍體細胞系，具有高度的數(shù)值復雜性和介于50-59的染色體模態(tài)數(shù)。因此，作者的目的是確定恢復野生型p53的功能是否可以將細胞中的染色體數(shù)量減少到接近二倍體的狀態(tài)。因此，每隔兩天用低劑量的p53-mRNA處理細胞，持續(xù)28天，并在孵育期結(jié)束時評估染色體的分布（圖2A-B）。當野生型p53恢復后，平均染色體數(shù)目從53減少到47（圖2C-D）。

HGSOC亞型的特征是由多種因素導致的復制應激增加，包括TP53的頻繁缺失。TP53功能的喪失通過損害DNA損傷反應機制來促進復制應激，這可能部分解釋了在OVCAR-8細胞中觀察到的遺傳不穩(wěn)定性增加。為了量化p53功能恢復前后OVCAR-8細胞中復制應激的程度，作者評估了Ser139-磷酸化H2AX焦點（γ-H2AX）作為復制應激的可靠標記，以及在7和14天后DNA雙鏈斷裂的存在。作者發(fā)現(xiàn)，在OVCAR-8和p53 mRNA處理的OVCAR-8細胞中，γ-H2AX焦點的基線水平在處理14天后從平均8個焦點顯著下降到3個焦點（圖2E）。這一結(jié)果進一步證明了p53在維持HGSOC細胞基因組完整性中發(fā)揮的關鍵作用，最有可能是通過對抗復制應激。

圖2 恢復p53功能可降低OVCAR-8細胞的染色體不穩(wěn)定性

3. 在原代HGSOC細胞中，基于mRNA的p53功能挽救誘導細胞周期停滯和細胞死亡

為了進一步驗證p53表達在臨床前的挽救作用，作者比較了p53 mRNA轉(zhuǎn)染在正常卵巢和HGSOC細胞中的作用。除角質(zhì)形成細胞外，所有原始樣本均檢測到p53的表達（圖3A）。對同一患者的HGSOC和相應的正常卵巢組織進行的第一次比較顯示，腫瘤細胞中p53的表達較高，盡管轉(zhuǎn)染的p53 mRNA的量相同（圖3A）。對其他患者來源組織的分析證實，所有腫瘤樣本中的p53表達和caspase 3/7活性（圖3B）均顯著高于正常卵巢細胞中的相應水平。

WB檢測揭示了抑制劑，p21，p16和p27的上調(diào)（圖3C）和凋亡（圖3D），在p53-mRNA-轉(zhuǎn)染的原代HGSOC細胞中，與它們的正常對應細胞相比，凋亡更強，與HGSOC克隆數(shù)量的更明顯減少相關（圖3E），這被LDH-Glo細胞毒性實驗證實（圖3F）。對不同HGSOC患者來源的類器官的分析也表明，在3D細胞培養(yǎng)條件下，p53 mRNA處理后，體積顯著減小，caspase 3/7活性增加（圖3G）。綜上所述，雖然p53的表達降低了兩種原代細胞的活（正常細胞vs. HGSOC），但與正常細胞相比，在原代HGSOC細胞中的作用顯著更強，這可能是由于p53在腫瘤細胞中的水平升高。

圖3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染p53-mRNA導致p53在原代HGSOC細胞中的表達高于其正常對照。

4. 拯救野生型p53功能后OVCAR-8細胞的轉(zhuǎn)錄組改變

在HGSOC來源的細胞系和原代細胞中，作者觀察到細胞增殖活性降低，細胞死亡增加，這支持了mRNA轉(zhuǎn)染后p53重新表達后恢復p53功能的模型。為了加深作者對潛在生物學過程的理解，并以相對無偏倚的方式解決這方面的問題，作者在三個獨立的實驗中轉(zhuǎn)染1μg p53 mRNA或模擬對照（EGFP mRNA）。總共有25540個人類基因在轉(zhuǎn)染后24小時被RNA測序分析?？紤]到組間差異，兩組均使用非配對T檢驗進行比較。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，3061個轉(zhuǎn)錄本被上調(diào)，1662個被下調(diào)（圖4A-B）。使用IPA軟件對這些重要基因進行進一步分析，以確定與p53 mRNA轉(zhuǎn)染相關的過度表達的經(jīng)典通路（圖4C）。

與p53作為腫瘤抑制因子參與誘導細胞周期停滯和凋亡的促凋亡功能相一致，作者的IPA揭示了p53 mRNA轉(zhuǎn)染后的幾個相關通路的過度表達，如“p53信號”、“凋亡信號”和幾個“細胞周期”通路（圖4C）。為了證實這些發(fā)現(xiàn)，作者研究了參與IPA“p53信號”通路的所有基因，作者意識到其中大多數(shù)（51/81，63%）在FDR q<0.05和絕對FC>1.5時存在差異表達（圖4D）。值得注意的是，p53信號通路的大多數(shù)已知下游靶點通過p53 mRNA轉(zhuǎn)染協(xié)同上調(diào)（圖4D）。作者對p53信號通路中選擇的蛋白（包括p21（CDKN1A）、MDM2、Puma（BBC3）、p73、FAS（CD95）和CDK1）進行WB，進一步驗證了這些結(jié)果（圖4E）。它們在OVCAR-8細胞中的表達被p53-mRNA顯著上調(diào)或下調(diào)，這與轉(zhuǎn)錄組學分析一致。

一些“細胞周期”途徑，包括“染色體復制的細胞周期控制”，“細胞周期：G2/M DNA損傷檢查點調(diào)節(jié)”，和“細胞周期蛋白和細胞周期調(diào)節(jié)”，以及“Polo樣激酶的有絲分裂作用”，它們顯示了整體下調(diào)（負z值）（圖4C）。值得注意的是，細胞衰老途徑也被上調(diào)，并可能在誘導凋亡的同時促進細胞死亡（圖4C）。

圖4 p53 mRNA轉(zhuǎn)染的OVCAR-8細胞與模擬轉(zhuǎn)染的OVCAR-8細胞相比，差異表達基因的鑒定

接下來，作者對來自患者1的原代HGSOC細胞和OVCAR-8細胞進行了轉(zhuǎn)錄組比較，OVCAR-8細胞和患者1的原代HGSOC細胞均轉(zhuǎn)染了p53-mRNA（圖5A）。主要樣本之間的高變異性導致多重檢驗FDR校正后的低顯著性。因此，作者認為原代HGSOC細胞的轉(zhuǎn)錄顯著性P<0.01和FC>1.5。共有156個轉(zhuǎn)錄本被上調(diào)，115個被下調(diào)（圖5B-C）。來自原代HGSOC細胞的幾個基因是顯著的，并且與在OVCAR-8細胞中發(fā)現(xiàn)的通路相似（圖5D），支持兩個數(shù)據(jù)集的相關性。

圖5 原代HGSOC細胞差異表達基因分析。

與p53在OC發(fā)育中的重要功能一致，作者的IPA顯示了“卵巢癌信號”通路中的多個轉(zhuǎn)錄改變。該通路中的許多基因（55/76，72%），包括Wnt/β-catenin信號通路，被顯著地解除調(diào)控（圖6A-B）。Wnt/β-catenin通路通過異常激活Wnt/β-catenin信號通路，導致catenin過度激活，從而促進卵巢癌的化療耐藥、轉(zhuǎn)移和腫瘤干細胞的自我更新。p53 mRNA的處理導致AXIN1的表達上調(diào)，AXIN1是β-catenin破壞復合物成分的腳手架蛋白，包括APC, CK1PP2A和GSK3β。此外，在frizzled受體、Wnt和TCF/LEF家族成員中觀察到異常（圖6A-B）?？傊?，在p53-mRNA處理的細胞中，這些轉(zhuǎn)錄改變導致β-catenin的適度減少（圖6B），并通過TCF/LEF報告基因?qū)嶒灲档?span>Wnt信號的活性（圖6C）。

圖6 IVT p53 mRNA處理OVCAR-8細胞后，OC信號通路上調(diào)。

5. 在HGSOC異種移植模型中，p53 mRNA處理的OVCAR-8細胞的原位應用導致了劑量依賴性的腫瘤生長減少

在異種移植實驗的前一天，OVCAR-8/Luc細胞被轉(zhuǎn)染mock-mRNA或p53-mRNA（100 ng或500 ng）（圖7A）。為了建立原位模型，將Matrigel/OVCAR-8/Luc細胞懸液注射到每只小鼠的右側(cè)卵巢。在為期10周的觀察期間，BLI以每周1倍的速度測定腫瘤體積，結(jié)果表明，100ng p53-mRNA處理的細胞產(chǎn)生的腫瘤生長遲緩，以及500ng p53-mRNA處理的細胞增殖完全受阻（圖7B）。為驗證熒光素酶在體內(nèi)的活性，研究結(jié)束后處死小鼠，由兩名獨立的獸醫(yī)組織學學家對所有器官進行解剖/組織學檢查?；隗w積測定（圖7C）和BLI測量（圖7D）對切除的卵巢的檢查證實了通過支持In vivo BLI測量的p53 mRNA治療對卵巢腫瘤的劑量依賴性大小減少（圖7B）。組織學檢查顯示巨大的腫瘤腫塊和深刻的形態(tài)學改變，這是由于在注射了模擬處理的OVCAR-8/Luc細胞的右側(cè)卵巢中巨大的癌組織。在100ng p53-mRNA處理組中，右側(cè)卵巢顯示出低到中等數(shù)量的腫瘤(圖7E，d-e)或正常組織學。500ng p53-mRNA處理組的右側(cè)卵巢和所有其他器官顯示正常組織學（圖7E，g-h）。在所有處理組（mock，100ng和500ng p53-mRNA）中，未接受OVCAR-8/Luc細胞的左側(cè)卵巢顯示出正常的組織學，具有卵泡和黃體結(jié)構(gòu)，以及基質(zhì)組織（圖7E，c-f-i)。在注射了mock-treated細胞的小鼠中，在腸道中檢測到轉(zhuǎn)移；100-ng組的轉(zhuǎn)移活性較低，在500-ng組中沒有轉(zhuǎn)移活性（圖7D-F）。總之，這些動物數(shù)據(jù)揭示了在原位條件下，p53 mRNA處理的OVCAR-8/Luc細胞的劑量依賴性生長遲緩和播散受阻。

圖7 在原位小鼠模型中，應用脂質(zhì)體p53-mRNA到OVCAR-8細胞可防止鞘內(nèi)生長和播散。

6. 腹腔內(nèi)應用OVCAR-8細胞，隨后腹腔內(nèi)治療p53-mRNA抑制腫瘤細胞的播散

為了進一步驗證p53-mRNA在轉(zhuǎn)移性HGSOC中的臨床相關性，作者測試了腹膜內(nèi)散在的腫瘤細胞是否可以被脂質(zhì)體p53-mRNA所接近。治療OC的藥物腹腔給藥被證明比全身給藥更有效，美國國立癌癥研究所推薦腹腔給藥。沿著這些路線，作者腹腔注射2×106 OVCAR-8/Luc細胞，并在4-6小時后通過腹腔途徑給予p53-mRNA。小鼠每周2次腹腔注射p53-mRNA（0.16mg/kg）或?qū)φ战M，共治療3周。盡管對照組的OVCAR-8/Luc細胞呈指數(shù)增長，但脂質(zhì)體p53-mRNA腹腔內(nèi)處理完全阻斷了腫瘤細胞的生長（圖8A）。在整個觀察期間，兩組小鼠體重發(fā)育正常（圖8B）。

在接受腹腔OVCAR-8/Luc細胞和腹腔模擬治療的對照小鼠中，大體解剖分析顯示腹膜表面有腫瘤塊（圖8C-D）。大多數(shù)轉(zhuǎn)移灶與臟器附著較弱。在大網(wǎng)膜、卵巢脂肪墊和腸系膜等脂肪組織中也檢測到大腫瘤（圖8C-D）。特別是，附著在小腸和大腸的較大腫瘤塊會導致腸道結(jié)構(gòu)之間的粘連，這意味著腸道狹窄。大網(wǎng)膜和腸道的IVIS測量顯示了最顯著的信號，與組織學結(jié)果相關（圖8D-E）。在p53-mRNA處理的小鼠中，大體解剖和組織學分析沒有發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)的腫瘤團塊，所有的器官在肉眼檢查中顯示正常。IVIS測量和組織學檢查沒有提供腫瘤細胞播散的證據(jù)（圖8D-E）。

圖8 腹腔內(nèi)注射OVCAR-8細胞后腹腔內(nèi)治療小鼠脂質(zhì)體p53-mRNA防止腫瘤形成和異種移植小鼠模型的器官播散。

結(jié)論：

該研究證明了IVT mRNA激活HGSOC中TP53腫瘤抑制基因的有效性。脂質(zhì)體IVT mRNA可有效、持續(xù)地表達WT p53，并精確挽救p53功能；從而抑制HGSOC細胞增殖，降低染色體不穩(wěn)定性，觸發(fā)細胞死亡。在不同的小鼠模型中，p53-mRNA治療導致了劑量依賴性的腫瘤生長和腹膜腔內(nèi)播散的減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，基于IVT-mRNA的方法有希望在癌細胞中重新激活p53，并可能為HGSOC提供一個有價值的治療選擇。

實驗結(jié)果：

細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，集落形成試驗，類器官，免疫印跡，細胞周期、細胞活力和增殖分析，熒光素酶檢測，乳酸脫氫酶細胞毒性測定，RNA測序，TCF/LEF報告基因檢測，小鼠實驗，活體成像系統(tǒng)，組織學檢查

參考文獻：

Raab M, Kostova I, Pe?a-Llopis S, Fietz D, Kressin M, Aberoumandi SM, et al. Rescue of p53 functions by in vitro-transcribed mRNA impedes the growth of high-grade serous ovarian cancer. Cancer Commun (Lond). 2024 Jan;44(1):101-126. doi: 10.1002/cac2.12511.