m6A甲基化酶ZCCHC4介導(dǎo)的LncGHRLOS參與結(jié)直腸癌的發(fā)生

          m6A修飾目前被認(rèn)為是維持癌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的RNA功能的主要驅(qū)動(dòng)因素。LncRNA控制細(xì)胞增殖，在結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。ZCCHC4是一種新發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，其在腫瘤中的作用和機(jī)制尚未闡明。我們報(bào)道了ZCCHC4-LncRNAGHRLOS-KDM5D軸在體外和體內(nèi)調(diào)控CRC的生長(zhǎng)。我們發(fā)現(xiàn)ZCCHC4在原發(fā)性結(jié)直腸癌樣本中表達(dá)上調(diào)，可以預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的不良臨床結(jié)局。機(jī)制上，ZCCHC4下調(diào)LncRNAGHRLOS促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。KDM5D作為LncRNAGHRLOS的下游分子，直接控制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究提示ZCCHC4軸參與結(jié)直腸癌的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，ZCCHC4可能是這種惡性腫瘤的潛在生物標(biāo)志物。本文于2024年2月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。

技術(shù)路線

結(jié)果：

1）ZCCHC4在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，預(yù)示結(jié)直腸癌預(yù)后不良

          為了確定m6A在不同消化道腫瘤中的表達(dá)程度，我們隨機(jī)選取5對(duì)有相鄰組織樣本的臨床腫瘤組織，評(píng)估m6A的總體修飾水平(圖1A-F)。HCC和CRC組織中m6A水平明顯高于鄰近正常組織。考慮到m6A在HCC中的廣泛研究，我們選擇CRC作為本研究的對(duì)象。同樣，我們?cè)?span>5個(gè)CRC標(biāo)本中檢測(cè)到一些關(guān)鍵的m6A成分。最后，我們證實(shí)了METTL3、FTO和ZCCCHC4在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)存在顯著差異(圖1G)。在敲除ZCCHC4后，在大多數(shù)CRC細(xì)胞系中觀察到m6A表達(dá)下降(圖1H)。為探討ZCCHC4在結(jié)直腸癌中是否存在異常表達(dá)，我們采用免疫組化方法檢測(cè)243例結(jié)直腸癌患者ZCCHC4的表達(dá)水平，并采用qPCR方法分析30例結(jié)直腸癌組織樣本中ZCCHC4 mRNA的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果顯示，175例患者腫瘤組織中ZCCHC4高表達(dá)，低表達(dá)患者僅占26.47%(圖1I)。ZCCHC4的mRNA水平在大多數(shù)結(jié)直腸癌組織中較高(圖1J)。對(duì)三對(duì)結(jié)直腸癌及其鄰近癌組織進(jìn)行western blot分析后也得到了類似的結(jié)果(圖1K)。此外，ZCCHC4高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者預(yù)后明顯差于低表達(dá)組(圖2A)。這些結(jié)果表明，ZCCHC4高表達(dá)與較差的OS相關(guān)。

2）ZCCHC4在體內(nèi)和體外均與結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有關(guān)

          為了確定ZCCHC4在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的潛在作用，我們首先評(píng)估了ZCCHC4在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)。我們檢測(cè)了幾種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中ZCCHC4的水平，發(fā)現(xiàn)與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460相比，大多數(shù)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中ZCCHC4的mRNA和蛋白水平均升高(圖2B-C)。通過Transwell細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究ZCCHC4對(duì)CRC細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響(圖2D)。結(jié)果顯示，在HCT-15細(xì)胞系中，與對(duì)照組相比，下調(diào)ZCCHC4表達(dá)可顯著降低CRC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。CCK-8結(jié)果顯示ZCCHC4下調(diào)可顯著抑制HCT-15和HCT116細(xì)胞的增殖(圖2E-F)。這些結(jié)果被傷口愈合實(shí)驗(yàn)證實(shí)(圖2G)。通過檢測(cè)細(xì)胞周期，我們觀察到ZCCHC4表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致HCT-116和HCT-15細(xì)胞系中處于G1期的CRC細(xì)胞比例更高(圖2H-I)。鑒于ZCCHC4對(duì)維持結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖至關(guān)重要，我們通過裸鼠異種移植模型驗(yàn)證了ZCCHC4在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生中的體內(nèi)作用。ZCCHC4高表達(dá)組CRC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，體積增大(圖3A-D)，腫瘤重量增加(圖3E)，預(yù)后差(圖3F)。免疫組化結(jié)果顯示，與過表達(dá)組相比，ZCCHC4缺陷腫瘤中細(xì)胞增殖的分子標(biāo)志物Ki-67減少，這表明ZCCHC4可能是CRC腫瘤發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素(圖3G)。

3）LncGHRLOS被鑒定為ZCCHC4的下游靶點(diǎn)

          為了探索ZCCHC4在結(jié)直腸癌中的潛在靶點(diǎn)，我們對(duì)表達(dá)ZCCHC4和對(duì)照結(jié)直腸癌細(xì)胞系進(jìn)行了RNA分析。RNA-seq結(jié)果顯示，ZCCHC4過表達(dá)后，大部分轉(zhuǎn)錄本下調(diào)?；鹕綀D用于可視化差異表達(dá)基因的總體分布(圖4A)?；虮磉_(dá)聚類分析用于確定不同處理下基因表達(dá)的聚類模式(圖4B)。將所有基因的蛋白序列和鑒定出的差異表達(dá)基因與UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的蛋白GO注釋對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)注(圖4 C)。使用R中的“clusterpro消化”包富集鑒定的差異表達(dá)基因在KEGG代謝途徑中(圖4D)。為了鑒定在ZCCHC4下游發(fā)揮關(guān)鍵作用的主要靶基因，基于MeRIP-seq結(jié)果，結(jié)合RNA seq結(jié)果中ZCCHC4過表達(dá)后發(fā)生顯著變化的基因，我們鑒定了11個(gè)共有基因(圖4E)。通過文獻(xiàn)檢索，我們選擇了CPA4、Col5A3、lncGHRLOS和CLEC18B作為ZCCHC4的潛在下游靶點(diǎn)(圖4F)。在10對(duì)結(jié)直腸癌組織和鄰近正常組織中檢測(cè)這些分子的mRNA表達(dá)后，我們發(fā)現(xiàn)兩組之間只有lncGHRLOS存在差異，我們將lncGHRLOS作為候選分子進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證(圖4G-J)。我們首先利用以上50個(gè)樣本的PCR結(jié)果描述了lncGHRLOS與ZCCHC4之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4K-L)。此外，在敲除ZCCHC4的表達(dá)后，我們檢測(cè)到CRC細(xì)胞系中lncGHRLOS mRNA水平顯著升高(圖4M)。RNA pull-down和RIP實(shí)驗(yàn)也顯示了ZCCCHC4和lncGHRLOS轉(zhuǎn)錄本之間的結(jié)合(圖4N-O)。值得注意的是，ZCCHC4消融減緩了CRC細(xì)胞中lncGHRLOS的降解，而ZCCHC4過表達(dá)加速了lncGHRLOS轉(zhuǎn)錄本的降解(圖4P)。因此，我們推測(cè)lncGHRLOS可能是ZCCHC4的下游效應(yīng)物。

4）LncGHRLOS在體外和體內(nèi)均能抑制結(jié)直腸癌的增殖、侵襲和遷移

          為了驗(yàn)證lncGHRLOS在CRC中的獨(dú)特作用，我們首先分析了CRC細(xì)胞系中的lncGHRLOS (圖5A)。CCK-8活性實(shí)驗(yàn)表明，沉默lncGHRLOS可有效增強(qiáng)CRC細(xì)胞的增殖能力，而增強(qiáng)lncGHRLOS的表達(dá)則會(huì)產(chǎn)生相反的生物學(xué)效應(yīng)(圖5B)。通過傷口愈合實(shí)驗(yàn)來確定細(xì)胞的遷移能力(圖5C-D)。我們的研究結(jié)果顯示，過表達(dá)lncGHRLOS后，CRC細(xì)胞的遷移能力與普通CRC細(xì)胞相比明顯降低，與低表達(dá)lncGHRLOS組相比存在顯著差異(圖5E)。隨后，我們用穩(wěn)定過表達(dá)lncGHRLOS的CRC細(xì)胞接種裸鼠，研究lncGHRLOS對(duì)致瘤性的影響。值得注意的是，lncGHRLOS的過表達(dá)減少了裸鼠CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤體積變小(圖5F-G)，腫瘤重量減輕(圖5H)，預(yù)后更好(圖5I)。免疫組化結(jié)果顯示，與相應(yīng)的對(duì)照組相比，lncGHRLOS過表達(dá)的腫瘤中細(xì)胞增殖的分子標(biāo)志物Ki-67下調(diào)(圖5J)。對(duì)結(jié)直腸癌患者樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)和ROC分析顯示，lncGHRLOS在臨床結(jié)直腸癌診斷中具有顯著的分化作用(圖5K)。根據(jù)隨訪結(jié)果繪制患者生存曲線。結(jié)果顯示，lncGHRLOS高表達(dá)組患者生存期較長(zhǎng)(圖5L)。

5）ZCCHC44和LncGHRLOS共同調(diào)控KDM5D的表達(dá)

          通過RNA下拉實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析研究LncGHRLOS的潛在下游靶點(diǎn)。質(zhì)譜分析表明，KDM5D可能在LncGHRLOS的m6A修飾中發(fā)揮作用(圖6A)。我們利用PCR結(jié)果的中位數(shù)將臨床標(biāo)本中KDM5D高表達(dá)和低表達(dá)的患者分組，發(fā)現(xiàn)KDM5D在結(jié)直腸癌中表達(dá)較低，其低表達(dá)在結(jié)直腸癌患者中預(yù)后較差(圖6B)。ELISA結(jié)果也顯示KDM5D有可能成為CRC的標(biāo)志物(圖6C)。選擇結(jié)直腸癌及癌旁組織進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，確定KDM5D mRNA水平(圖6 D)。此外，在結(jié)直腸癌中，LncGHRLOS與KDM5D mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(圖6E)。細(xì)胞系驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低LncGHRLOS后，KDM5D的表達(dá)顯著降低(圖6F-H)。重要的是，我們?cè)u(píng)估了敲低和過表達(dá)KDM5D后LncGHRLOS mRNA的穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放線菌素D處理下，過表達(dá)KDM5D后，LncGHRLOS的mRNA穩(wěn)定性顯著提高，而敲低KDM5D后，LncGHRLOS的mRNA穩(wěn)定性顯著降低(圖6I)。在許多CRC細(xì)胞系中觀察到KDM5D mRNA的表達(dá)顯著降低(圖6J)。接下來，我們使用傷口愈合實(shí)驗(yàn)(圖6K)、CCK-8實(shí)驗(yàn)(圖6L)、transwell實(shí)驗(yàn)(圖6M)和流式細(xì)胞術(shù)(圖6N)來驗(yàn)證KDM5D敲低和過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。我們發(fā)現(xiàn)KDM5D的高表達(dá)降低了HCT-116細(xì)胞的增殖和遷移能力。細(xì)胞周期在G0/G1期停滯。此外，我們進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來闡明KDM5D對(duì)CRC的影響。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，KDM5D低表達(dá)組CRC細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)能力增強(qiáng)，體積增大(圖6O-P)，腫瘤重量增大(圖6Q)， Ki-67指數(shù)增大(圖6S)。但與以往實(shí)驗(yàn)不同的是，兩組小鼠的生存時(shí)間沒有顯著差異(圖6R)。

結(jié)論：

          我們的研究確定了ZCCHC4是CRC不良預(yù)后的新預(yù)測(cè)因子和潛在的治療靶點(diǎn)，為其在癌癥進(jìn)展中的作用提供了機(jī)制見解。

實(shí)驗(yàn)方法：

          m6A RNA甲基化試驗(yàn)，ELISA，IHC，Western blot，qRT-PCR，MeRIP-seq，RIP，transwell，傷口愈合試驗(yàn)，RNA下拉，質(zhì)譜。

參考文獻(xiàn)：

          Chen K, Zhang J, Meng L, Kong L, Lu M, Wang Z, Wang W. The epigenetic downregulation of LncGHRLOS mediated by RNA m6A methylase ZCCHC4 promotes colorectal cancer tumorigenesis. J Exp Clin Cancer Res. 2024 Feb 7;43(1):44. doi: 10.1186/s13046-024-02965-5.