腸道微生物組衍生的丁酸鹽抑制胃癌腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的免疫抑制因子PD-L1和IL-10

早期發(fā)現(xiàn)和手術(shù)治療對胃癌（GC）取得良好療效至關(guān)重要，IV期和復(fù)發(fā)性GC預(yù)后較差，所以需要新的GC治療方法。之前的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物組是GC的一個致病因素，因此本文對胃癌患者的腸道微生物組進(jìn)行了研究，并試圖通過調(diào)節(jié)微生物組代謝物來逆轉(zhuǎn)GC患者免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞的免疫抑制,評估GC患者外周血免疫細(xì)胞中程序性死亡配體1（PD-L1）和白細(xì)胞介素（IL）-10的水平。通過共聚焦顯微鏡觀察癌癥組織的染色切片,利用健康人和GC患者的糞便樣本分析腸道微生物組。通過將晚期GC（AGC）患者的外周血單核細(xì)胞（PBMC）注射到NSG小鼠體內(nèi)，然后再注射AGS細(xì)胞，建立人源化模型。與健康對照組相比，GC患者免疫細(xì)胞中PD-L1和IL-10的表達(dá)水平更高,腸道菌群中糞桿菌和雙歧桿菌的豐度較低,免疫抑制因子在腫瘤組織的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的水平均有所升高。最近的研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽是一種具有代表性的微生物代謝物，具有抗腫瘤作用，并與增強(qiáng)免疫治療的治療應(yīng)答相關(guān)。本文評估了丁酸鹽在人源化小鼠模型中的抗腫瘤作用，結(jié)果表明丁酸鹽可抑制免疫細(xì)胞中PD-L1和IL-10的表達(dá)水平。此外，在人源化小鼠模型中，AGC患者的PBMCs顯示免疫抑制因子水平升高。丁酸鹽抑制了小鼠的腫瘤生長。文章首次發(fā)現(xiàn)丁酸鹽作為胃癌的代表性代謝物，其抗腫瘤作用是通過調(diào)節(jié)免疫抑制標(biāo)志物的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，為GC的治療方法的開發(fā)提供了新思路。本文于2023年12月發(fā)表在《Gut Microbes》，IF：12.2。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.AGC患者樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中免疫抑制標(biāo)志物水平升高

眾所周知，包括胃癌在內(nèi)的各種癌癥都會增加免疫抑制標(biāo)記物的表達(dá)。文章研究了GC患者的PBMC（巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）和癌粘膜中免疫抑制標(biāo)記物（包括PD-L1和IL-10）的表達(dá)水平。與EGC患者相比，AGC患者的PBMC（圖1）和癌癥粘膜（圖2）中有更多的PD-L1和IL-10表達(dá)的巨噬細(xì)胞（CD68+細(xì)胞）、PD-L1和IL-10表達(dá)的樹突狀細(xì)胞（CD11c+細(xì)胞）以及PD-L1和IL-10表達(dá)的巨噬細(xì)胞。數(shù)據(jù)表明，免疫抑制與GC的進(jìn)展有關(guān)。

圖1.AGC患者PBMC中免疫抑制標(biāo)志物水平升高

圖2.AGC患者腫瘤粘膜中免疫抑制標(biāo)志物水平升高

2.GC患者腸道微生物組的菌群失調(diào)

為了研究GC是否與腸道微生物組的變化有關(guān)，對20名HCs和12名GC患者的糞便樣本進(jìn)行了測序。與HCs相比，GC患者的微生物群菌群種類和豐富度較低（圖3a）。使用基于Bray-Curtis相異性（β多樣性）的主坐標(biāo)分析法評估并比較了GC患者和HC之間腸道微生物組組成的整體多樣性。HC和GC患者的腸道菌群存在明顯差異（圖3b）。GC患者的腸道微生物組成發(fā)生了改變（圖4）。在門一級，與HCs相比，GC患者的放線菌和芽孢桿菌含量較低，而類桿菌含量較高（圖4a）。在科一級，與丁酸生產(chǎn)有關(guān)的雙歧桿菌和瘤胃球菌在GC患者中的豐度低于HC患者，而類桿菌的豐度高于HC患者（圖4b）。在菌屬水平上，GC患者腸道菌群中產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌也有所減少（圖4c）。GC患者和HC線性判別分析（LDA）得分之間的細(xì)菌類群相對豐度在屬一級也存在明顯差異（圖4d）。與HC相比，GC患者體內(nèi)糞桿菌、柯林斯菌、雙歧桿菌、f_瘤胃球菌和瘤胃球菌（即產(chǎn)丁酸菌株）的豐度顯著降低（圖4e）。此外，與EGC相比，AGC患者中糞桿菌、柯林斯菌、雙歧桿菌、f_瘤胃球菌和瘤胃球菌（即產(chǎn)丁酸菌株）的豐度也明顯降低（圖4f）。

圖3.GC患者的腸道微生物群譜

圖4.GC患者體內(nèi)微生物豐度的差異

3.丁酸鹽治療抑制GC患者PBMC中PD-L1和IL-10的表達(dá)

包括糞桿菌在內(nèi)的丁酸菌株在GC患者中的豐度低于HCs。文章研究了丁酸鹽和糞桿菌在GC患者中的作用。給GC患者的PBMC和THP-1細(xì)胞注射丁酸鹽和糞桿菌，可減少表達(dá)PD-L1和IL-10的巨噬細(xì)胞數(shù)量（圖5a、b）。此外，丁酸鹽和糞桿菌還能降低IL-10的濃度（圖5c）。

圖5.丁酸鹽降低PD-L1和IL-10水平

4.丁酸鹽抑制GC細(xì)胞的生長

接下來，文章研究了丁酸鹽對胃癌細(xì)胞生長的影響。文章作者用丁酸鹽培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞，并測量細(xì)胞的生長情況。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，丁酸鹽明顯抑制了AGS細(xì)胞的生長（圖6a）。隨后研究了丁酸鹽對GC細(xì)胞體內(nèi)生長的影響。為此在有或無丁酸鹽條件下向人源化腫瘤小鼠模型皮下注射了來自健康對照組或GC患者的AGS細(xì)胞和PBMCs（圖6b、c）。丁酸鹽能明顯減小腫瘤大小，降低免疫抑制標(biāo)志物（PD-L1和IL-10）、其調(diào)節(jié)因子（NF-KB和STAT3）以及癌癥組織中的癌生長因子（VEGF和GDF-15）的水平（圖6d、e）。數(shù)據(jù)表明，丁酸鹽可通過抑制胃癌癌細(xì)胞的生長而發(fā)揮潛在的治療作用。

圖6.丁酸鹽抑制腫瘤細(xì)胞生長

實(shí)驗(yàn)方法：

微生物組學(xué)分析、免疫染色切片、流式細(xì)胞術(shù)、PCR擴(kuò)增，DNA測序、共聚焦顯微鏡分析、免疫組織化學(xué)檢測、人源化小鼠模型、酶聯(lián)免疫吸附測定

參考文獻(xiàn)：

Lee SY, Jhun J, Woo JS, Lee KH, Hwang SH, Moon J, Park G, Choi SS, Kim SJ, Jung YJ, Song KY, Cho ML. Gut microbiome-derived butyrate inhibits the immunosuppressive factors PD-L1 and IL-10 in tumor-associated macrophages in gastric cancer. Gut Microbes. 2024 Jan-Dec;16(1):2300846. doi: 10.1080/19490976.2023.2300846. Epub 2024 Jan 10. PMID: 38197259; PMCID: PMC10793689.