腫瘤細(xì)胞來源的LC3B+細(xì)胞外囊泡通過HSP90α-IL-6/IL-8軸介導(dǎo)HCC腫瘤微環(huán)境與免疫治療效果之間的串?dāng)_

         肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，其中肝細(xì)胞癌（hepatocellular cancer， HCC）占70%-85%。最近，ICIs治療在晚期HCC患者中顯示出有希望的療效和可控的安全性，這表明靶向腫瘤微環(huán)境是一種治療癌細(xì)胞的策略。腫瘤微環(huán)境中慢性炎癥和炎癥介質(zhì)水平增加，如IL-6和IL-8，可以將免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)重定向到促癌方向。腫瘤細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡（EV）已經(jīng)成為一種新的細(xì)胞間通訊模式，充當(dāng)生物活性分子的載體來影響腫瘤微環(huán)境。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)血漿IL-6和IL-8在肝癌患者中高度表達(dá)，這與總生存期短（OS）相關(guān)，并且主要由單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌。此外，證明了LC3B+EVs上攜帶的HSP90α對(duì)于LC3B+EVs誘導(dǎo)的IL-6和IL-8分泌至關(guān)重要，這抑制了CD8+T細(xì)胞活性。使用體外研究的組合發(fā)現(xiàn)PD-1和HSP90α、IL-6或IL-8的聯(lián)合阻斷可以協(xié)同恢復(fù)CD8+T細(xì)胞功能。最后，MAP1LC3B、HSP90AA1、IL6或IL8高表達(dá)的患者抗PD-1/PD-L免疫治療效果較低?？傮w而言，靶向HSP90α、IL-6或IL-8與PD-1抑制劑聯(lián)合使用是HCC患者的有效新策略。

         該研究于2024年2月3日發(fā)表在《Clinical Immunology》，IF：8.6。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. 肝癌患者血漿高IL-6、IL-8與預(yù)后不良的關(guān)系

         為了探討肝癌患者可能存在的免疫系統(tǒng)失調(diào)，采用流式熒光免疫微珠法檢測(cè)外周血中12種細(xì)胞因子（IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70和IL-17）。發(fā)現(xiàn)肝癌患者中只有IL-6和IL-8顯著高于健康供者（圖1A和B）。此外，為了闡明與肝癌患者預(yù)后相關(guān)的IL-6或IL-8基因，根據(jù)Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站的數(shù)據(jù)進(jìn)行了總生存期（OS）分析。結(jié)果表明，IL6，特別是IL8的高表達(dá)與較短的OS相關(guān)，并預(yù)測(cè)預(yù)后不良（圖1C）。還發(fā)現(xiàn)在有或沒有肝炎病毒感染或飲酒的肝癌患者中，IL8的高表達(dá)都與較短的OS相關(guān)（圖1D和E）。這些發(fā)現(xiàn)表明IL-6和IL-8可能參與肝癌的進(jìn)展。

圖1：肝癌患者血漿白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8水平較高，與較差的生存率相關(guān)

2. 肝癌細(xì)胞來源的EVs在體外作為IL-6和IL-8分泌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

         為了了解肝癌細(xì)胞分泌IL-6和IL-8的關(guān)鍵因素，在抗CD3/抗CD28存在下，將肝癌細(xì)胞與健康供體的白細(xì)胞共孵育。值得注意的是，肝癌細(xì)胞可以誘導(dǎo)白細(xì)胞分泌IL-6和IL-8。當(dāng)通過transwell室與白細(xì)胞分離時(shí)，IL-6和IL-8的分泌也增加了（圖2A）。此外，通過在14,000 g離心30分鐘從腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中耗盡EVs，導(dǎo)致白細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8的顯著減少（圖2B）。這些數(shù)據(jù)表明腫瘤細(xì)胞來源的大EVs是誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的關(guān)鍵物質(zhì)之一。

圖2：肝癌細(xì)胞來源的EVs是誘導(dǎo)白細(xì)胞分泌IL-6和IL-8的關(guān)鍵物質(zhì)之一

3. 肝癌患者血漿LC3B+EVs與IL-6、IL-8的相關(guān)性

之前的觀察突出表明，攜帶HSP90α的LC3B+EVs是能夠促進(jìn)CD4+T細(xì)胞促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)EVs。與作者之前的研究一致，肝癌患者血漿中LC3B+EVs和HSP90α+LC3B+EVs的比例明顯高于健康供體（HD）組（圖3A、B、C和D）。正如預(yù)期的那樣，相關(guān)分析結(jié)果顯示，LC3B+EVs，特別是HSP90α+LC3B+EVs的水平與IL-6和IL-8水平顯著正相關(guān)（圖3E）。與這一結(jié)果一致的是，基于TIMER 2.0的LC3B蛋白編碼基因MAP1LC3B和HSP90α蛋白編碼基因HSP90AA1與IL6和IL8呈正相關(guān)（圖3F和G）。此外，GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)還顯示肝癌患者MAP1LC3B和HSP90AA1表達(dá)較高，預(yù)后較差（圖3H和I）。綜上所述，這些結(jié)果表明腫瘤來源的LC3B+EVs可能是誘導(dǎo)IL-6和IL-8分泌的關(guān)鍵物質(zhì)。

圖3：肝癌患者血漿LC3B+EVs水平較高，與預(yù)后不良相關(guān)

4. LC3B+EVs通過HSP90α促進(jìn)白細(xì)胞來源的IL-6和IL-8分泌

         為了確定LC3B+EVs是否影響體外IL-6和IL-8分泌，首先從人肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分離并鑒定了LC3B+EVs。HSP90α和自噬體標(biāo)記LC3-I/II在LC3B+EVs中高度豐富，而CD63和CD9也存在，但水平要低得多（圖4A、B和C）。與自噬體的特征相似，LC3B+EVs被發(fā)現(xiàn)具有直徑為200至600 nm的雙膜結(jié)構(gòu)（圖4D和E）。在抗CD3和抗CD28激活期間用LC3B+EVs處理人類白細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)LC3B+EVs在上調(diào)IL-6和IL-8分泌方面比LC3B?EVs更有效，這表明LC3B+EVs是指導(dǎo)白細(xì)胞的主導(dǎo)EVs（圖4F）。

         為了確定LC3B+EVs上存在的HSP90α在誘導(dǎo)白細(xì)胞分泌IL-6和IL-8中的作用，用HSP90α抗體阻斷LC3B+EVs表面的HSP90α減弱了LC3B+EVs誘導(dǎo)的IL-6和IL-8分泌，表明膜結(jié)合的HSP90α在LC3B+EVs上起著重要作用（圖4G）。此外，用HSP90α抗體預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液（SN）或超速離心耗盡EVs進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果（圖4H）。為了進(jìn)一步證實(shí)HSP90α對(duì)LC3B+EVs的特異性作用，用HSP90αsiRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，發(fā)現(xiàn)HSP90α在細(xì)胞和純化的LC3B+EVs中的表達(dá)都明顯降低（圖4I）。ELISA檢測(cè)顯示，與轉(zhuǎn)染非靶向?qū)φ?span>siRNA的細(xì)胞的LC3B+EVs相比，轉(zhuǎn)染HSP90α-siRNA的細(xì)胞的LC3B+EVs誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8的能力降低（圖4J）。這些結(jié)果表明，攜帶HSP90α的LC3B+EV是誘導(dǎo)IL-6和IL-8分泌的關(guān)鍵生物活性分子。

圖4：LC3B+EVs上的HSP90α對(duì)白細(xì)胞中IL-6和IL-8的誘導(dǎo)至關(guān)重要

5. IL-6和IL-8主要由單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌

         IL-6和IL-8可由許多細(xì)胞產(chǎn)生，但主要來源仍不清楚。肝癌患者流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，肝癌患者的IL-6和IL-8產(chǎn)生自CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例較高，尤其是CD14+單核細(xì)胞（圖5A和B）。此外，根據(jù)FACS分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)IL-6和IL-8主要由CD14+單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌（圖5C和D）。上述結(jié)果提示IL-6和IL-8主要來自肝癌患者外周血中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。

圖5：IL-6和IL-8主要由肝癌中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌

6. IL-6和IL-8有助于免疫抑制微環(huán)境

         為了評(píng)估IL-6 / IL-8與炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系，檢查了血漿IL-6 / IL-8水平與選定的循環(huán)免疫細(xì)胞群體之間的關(guān)聯(lián)。循環(huán)IL-6 / IL-8水平與血液中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值（MLR）、中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值（NLR）正相關(guān)，與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)量負(fù)相關(guān)（圖6A）。此外還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)IL-6 / IL-8肝癌患者中CD-L1、CD14+單核細(xì)胞上CD163和CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)顯著增加（圖6B）。與此現(xiàn)象一致的是，在TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)IL-6 、 IL-8水平與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平或PDCD1、CD274、CD163表達(dá)水平之間存在顯著相關(guān)性（圖6C）。此外，與上述發(fā)現(xiàn)一致，TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)還顯示，MAP1LC3B、HSP90AA1 mRNA水平高的肝癌患者顯示出高的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平，或PDCD1、CD274、CD163表達(dá)水平（圖6D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，高水平的IL-6和IL-8有助于肝癌患者的免疫抑制微環(huán)境。

圖6：白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8與免疫抑制微環(huán)境顯著相關(guān)

7. LC3B+EVs通過HSP90α-IL-6/IL-8軸促進(jìn)免疫抑制功能

         為了進(jìn)一步確保LC3B+EVs誘導(dǎo)的IL-6和IL-8分泌有助于免疫抑制功能，在體外用LC3B+EVs聯(lián)合HSP90α、IL-6和IL-8阻斷抗體處理白細(xì)胞，并通過FACS分析。正如預(yù)期的那樣，LC3B+EVs處理后，總CD8+T細(xì)胞中IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比降低，而阻斷HSP90α、IL-6或IL-8顯著逆轉(zhuǎn)了LC3B+EVs阻斷CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的情況（圖7A和B）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α的水平升高（圖7C）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明LC3B+EVs誘導(dǎo)的白細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，包括IL-6和IL-8，參與了適應(yīng)性免疫抑制功能。

圖7：LC3B+EVs通過HSP90α-IL-6/IL-8軸促進(jìn)免疫抑制功能

8. 聯(lián)合阻斷PD-1和HSP90α、IL-6、IL-8可恢復(fù)T細(xì)胞功能

         作者評(píng)估阻斷HSP90α、IL-6或IL-8是否能增強(qiáng)PD-1誘導(dǎo)的T細(xì)胞活力。為此，分離了健康供者的白細(xì)胞，并在抗CD3/CD28存在下用LC3B+EVs處理，這抑制了CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌功能（圖8A和B）。令人驚訝的是，抗PD-1阻斷抗體增加了IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例，而與HSP90α、IL-6或IL-8阻斷抗體聯(lián)合處理進(jìn)一步增強(qiáng)了這一比例（圖8A和B）。此外，抗PD-1阻斷抗體也增加了培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α的分泌，并通過聯(lián)合處理進(jìn)一步增強(qiáng)了這一比例（圖8C）。值得注意的是，與PD-1、IL-6和IL-8阻斷抗體聯(lián)合處理并沒有進(jìn)一步協(xié)同增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的功能。這些結(jié)果表明，靶向HSP90α的LC3B+EVs、IL-6或IL-8可以與抗PD-1單克隆抗體協(xié)同增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的功能，這可能為臨床治療肝癌提供一種新的方式。

圖8：聯(lián)合阻斷PD-1和HSP90α、IL-6或IL-8增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞功能

9. LC3B+EVs-HSP90α-IL-6/IL-8軸預(yù)測(cè)免疫治療療效

         為了進(jìn)一步探討LC3B+EVs-HSP90α-IL-6/IL-8信號(hào)軸與免疫治療之間的關(guān)系，首先分析了來自癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集的選定腫瘤隊(duì)列中的腫瘤突變負(fù)擔(dān)（TMB），這是與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）療效相關(guān)的潛在因素，并發(fā)現(xiàn)MAP1LC3B、HSP90AA1、IL6或IL8轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平與TMB之間的低相關(guān)性（圖9A）。這些結(jié)果表明LC3B+EVs-HSP90α-IL-6/IL-8軸介導(dǎo)的免疫治療效果與TMB無關(guān)。隨后，來自TCGA數(shù)據(jù)集的患者根據(jù)IPS分為低免疫反應(yīng)組和高免疫反應(yīng)組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，高免疫反應(yīng)組中使用PD-1/PD-L1抑制劑治療的肝癌患者的整體生存率（OS）（圖9B）和PFS（圖9C）與低免疫反應(yīng)組患者相比。在高免疫反應(yīng)隊(duì)列中，高MAP1LC3B和HSP90AA1表達(dá)水平均與PD-1/PD-L1抑制劑治療的肝癌患者OS預(yù)后較差相關(guān)（圖9D）。同時(shí)，盡管沒有顯著差異，但IL6或IL8低的患者比IL6或IL8高的患者預(yù)后相對(duì)更好（圖9D）。然而，低免疫反應(yīng)組HSP90AA1或IL8高表達(dá)的患者OS明顯比IL6或IL8低的患者差（圖9E）。這些結(jié)果表明，LC3B+EVs-HSP90α-IL-6/IL-8軸對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑治療的肝癌患者預(yù)后較差。

圖9：PD-1/PD-L1抑制劑治療肝臟患者MAP1LC3B、HSP90AA1、IL6、IL8水平與TMB、免疫治療效果的關(guān)系

結(jié)論

         作者發(fā)現(xiàn)攜帶HSP90α-IL-6/IL-8軸的LC3B+EVs在驅(qū)動(dòng)肝癌患者CD8+T細(xì)胞功能障礙中的基本作用。阻斷LC3B+EVs-HSP90α-IL-6/IL-8信號(hào)軸可與PD-1/PD-L1抑制劑協(xié)同恢復(fù)CD8+T細(xì)胞功能?；趶?fù)雜的腫瘤免疫微環(huán)境和發(fā)現(xiàn)，未來的臨床評(píng)估側(cè)重于抑制多個(gè)靶點(diǎn)，包括靶向LC3B+EVs上的HSP90α、IL-6或IL-8，聯(lián)合ICI可能會(huì)改善肝癌患者的預(yù)后。

參考文獻(xiàn)

         Astier Clémence, Ngo Carine, Colmet-Daage Léo, Marty Virginie, Bawa Olivia, Nicotra Claudio, Ngo-Camus Maud, Italiano Antoine, Massard Christophe, Scoazec Jean-Yves, Smolenschi Cristina, Ducreux Michel, Hollebecque Antoine, Postel-Vinay Sophie. (2024). Molecular profiling of biliary tract cancers reveals distinct genomic landscapes between circulating and tissue tumor DNA. Exp Hematol Oncol, 13(1), 2. doi:10.1186/s40164-023-00470-7.