乳腺癌的Notch轉錄組標記的鑒定

失調的Notch信號是乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的原因之一，但目前還缺乏有效的工具來測量乳腺癌亞型中的Notch信號水平以及對全身治療的反應。有必要建立 Notch 信號的轉錄組特征，例如用于監(jiān)測未來 Notch 靶向療法的效果，以及了解 Notch 信號的改變是否是當前乳腺癌療法的脫靶效應。在本報告中，作者選出了一個最佳的 20 個基因轉錄組特征。在兩個獨立的患者數據集（METABRIC 和 Oslo2）上對該特征進行了驗證，與之前發(fā)表的特征相比，它的一致性得分和腫瘤特異性都有所提高。此外，基底樣乳腺癌的特征得分特別高，表明這種亞型的 Notch 信號水平更高。在 PROMIX 和 BEAUTY 患者隊列中，經過新輔助治療后，特征得分有所提高，較低的特征得分通常與較好的臨床預后相關?？傊狙芯拷⒌?span>20 個基因轉錄特征將成為評估未來乳腺癌 Notch 靶向療法反應、了解傳統(tǒng)乳腺癌療法對 Notch 信號的潛在影響以及更好地對患者進行治療分層的重要工具。本文于2024年1月發(fā)表在《Breast Cancer Research》IF:7.4期刊上。

技術路線：

主要實驗結果：

1、一種鑒定Notch轉錄組特征候選基因的試驗

為確定乳腺癌的Notch轉錄特征，首先確定了在乳腺癌背景下由Notch信號調節(jié)的基因。為此，對表達Notch信號的6個基底樣乳腺癌細胞系中進行轉錄組測序。這些細胞系進行Notch信號激活（Jagged1誘導）和Notch信號阻斷（DAPT誘導）處理，DMSO處理細胞作為“ground state”對照（圖1B）。在激活/抑制后8和72小時，對6個細胞系進行轉錄組分析，以捕獲由Notch調節(jié)引起的即時以及更長期的基因表達差異（圖1B）。抑制或阻斷效率通過qPCR檢測經典Notch靶基因HES1和NRARP的表達驗證。結果顯示在分析的6個細胞系中，在8和/或72 h后，每個細胞系中至少有一個已建立的Notch靶基因HES1和NRARP出現預期的上調和下調（圖1C），表明實驗有效。在轉錄組數據的PCA中，細胞系彼此明顯聚集， Notch信號的激活或阻斷并沒有重置整個轉錄組景觀，而是誘導了更微妙的差異（圖1D）。因此，變異的主要來源是細胞系之間的轉錄組差異，其次是處理時間，而Notch調節(jié)的影響較小，與主成分6、7和10顯著相關，分別占數據集中總方差的3.5%、2.1%和0.5%（圖1E）。總之，作者已經建立了一種檢測方法，能夠識別基底樣乳腺癌細胞系中Notch誘導的轉錄組差異，并建立Notch標記的候選基因。

圖1 在基底樣乳腺癌細胞系中鑒定Notch調節(jié)基因的試驗

2、鑒定一個強大和連貫的20個基因轉錄組的Notch信號

利用Notch信號在8h和72h時間點的激活或阻斷數據集，在6個細胞系的所有可能條件和時間點之間搜索差異表達基因（DEGs）。由于Notch信號會導致下游基因表達的增加和減少，作者考慮不同實驗點由上調或下調基因組成的DEG和潛在特征。在74個可能的比較中，作者只考慮了左偏P值分布和至少100個的DEGs的差異表達結果（圖2A），從而選擇了14個比較結果（圖2B）。

為確定最佳特征長度，作者計算了TCGA-BRCA患者隊列中候選比較中每個數目的基因的平均基因-基因相關性（一致性評分），作為訓練隊列。在10 ~ 30個基因的范圍內，根據最大的一致性評分和最小的經驗P值來選擇每個特征中的最優(yōu)基因數。該分析揭示了一致性評分> 0.2的三個特征：特征#5（15個基因）；特征#9：（17個基因）和特征# 11（20個基因）（圖2C）。選取這三個特征進行進一步分析。為進一步探索這三個特征的準確性和穩(wěn)健性，作者使用如上所述的相同的實驗生成了一個新的轉錄組數據集，用于激活(Jagged1)和阻斷(DAPT) Notch信號，但這次來自19個乳腺癌細胞系，包括10個基底樣細胞系，三個來自Luminal A的細胞系，和6個HER2富集的乳腺癌細胞系（圖2D）。來自19個處于基態(tài)（即沒有Notch信號干擾）的細胞系的轉錄組顯示，在PCA分析中，基底樣、Luminal A和her2富集細胞系根據腫瘤亞型明顯聚集（圖2E）。 對于6種基底樣細胞系的轉錄組分析(圖1D)，與細胞系特異性差異相比，Notch信號升高或降低誘導的轉錄組差異較?。▓D2E）。接下來，使用GSEA和ROC曲線分析來測試這三個特征在19個細胞系轉錄組上的表現。特征#11來自Notch打開和Notch關閉的8h和72h時間點的上調DEG的交集，在三種不同條件下的GSEA分析中，它們的表現始終優(yōu)于特征#5和#9（圖2F）。總的來說，基于TCGA-BRCA患者數據集和獨立Notch信號調制細胞系數據集的訓練數據的特征#11表現出最好的性能，因此被用于隨后的分析。

圖2 20個基因Notch轉錄組特征的鑒定

3、20個基因轉錄組Notch信號的性質

選擇的轉錄組特征#11按順序包括以下20個基因：SEMA5B、NRARP、PLAT、PRELP、HEYL、FAT2、HEY1、KRT5、NPR3、KRT14、FLT1、RHOV、TNFRSF19、JAG1、MT1X、HEY2、PDGFRB、ZNF469、VSNL1和KIT（圖3A）。所有20個基因都含有至少一個CSL結合位點，位于啟動子區(qū)域，定義為轉錄起始位點(TSS)上游的3000 bp和下游的500 bp（圖3B），其中17個基因（SEMA5B, NRARP, PRELP, HEYL, FAT2, HEY1, KRT5, NPR3, KRT14, FLT1, RHOV, TNFRSF19, JAG1, MT1X, HEY2, PDGFRB和ZNF469）先前已在ChIP-seq中使用來自不同模型的細胞系確定為CSL靶點。當這些基因被繪制在一個KEGG圖網絡中時，標記中的一些基因(JAG1, HEY1, HEY2和HEYL)與“乳腺癌”一詞相關，而同樣的四個基因加上PDGFRB和KIT與“癌癥途徑”一詞相關（圖3C）?？傊瑪祿砻?span>Notch信號中的20個基因可能代表Notch的直接下游基因，其中一些基因與不同的疾病相關，如乳腺癌或通路富集分析中的Notch。

圖3 20個基因的Notch轉錄組特征

4、將20個基因的Notch轉錄組特征與先前建立的特征進行比較

通過計算一致性得分以及經驗P值來估計已發(fā)表特征的質量。在 TCGA-BRCA、METABRIC 和 Oslo2 數據集中，57 個已分析的已發(fā)表特征中，分別有 9 個、4 個和 7 個特征的一致性得分大于 0.12。在 TCGA、METABRIC 和 Oslo2 數據集中，分別有 10 個、9 個和 6 個特征的調整后經驗p值小于 0.0001。Vilimas等人的 "NOTCH1靶向下 "特征顯示出比20個基因特征更高的一致性得分（TCGA-BRCA = 0.28，METABRIC = 0.19和Oslo2 = 0.22）（圖4A）。一個重要的問題是，腫瘤純度、基質和免疫浸潤是否會對各種基因特征的性質產生影響。為解決這個問題，使用ESTIMATE方法推斷了免疫和基質含量。包括本文報告的 20 個基因特征在內的大多數特征與 Immunescore 或 Stromalscore 沒有明顯的相關性，但 Vilimas 等人和 Klinakis 等人的特征與免疫浸潤高度相關，而其他兩個特征則與所有測試患者隊列中的基質含量相關（圖4B）?？傊?，本文的20個基因特征在所有測試和驗證步驟中得分都很好，并且在大多數情況下優(yōu)于先前描述的特征。

圖4 將20基因特征與先前建立的Notch簽名進行比較

5、20個基因特征在基底樣乳腺癌細胞系和患者數據集中顯示出更高的評分

在患者和細胞系數據集中驗證了 20 個基因特征的一致性得分后，接下來利用該特征來了解不同的乳腺癌亞型是否具有不同水平的 Notch 信號。首先重新研究了代表基底樣、Luminal A 和 HER2 富集亞型的 19 個細胞系的轉錄組分析。在基底樣細胞系中，基底狀態(tài)下的絕對特征得分明顯更高（圖5A），在基底樣細胞系中，比較 "Notch開啟"和 "Notch關閉"條件下與ground state狀態(tài)下的相對特征得分差異顯著（圖5B）。此外，與ground state特征得分相比，相對特征得分在 "Notch開啟"條件下增加，而在 "Notch關閉"條件下減少（圖5C）。接下來，研究了三個患者數據集中 20 個基因特征的特征得分與 PAM50 分子亞型分類的關系。在 TCGA、METABRIC 和 Oslo2 數據集中，基底樣/TNBC 和正常型乳腺癌的平均特征得分最高，其次是 Luminal A 亞型，HER2 和 Luminal B 亞型的特征得分較低（圖5D）?？傊?，結果顯示基底樣亞型的特征得分較高。

圖5 不同亞型乳腺癌中20個基因特征的特征評分

6、利用PROMIX和BEAUTY隊列分析20個基因特征的乳腺癌治療反應

為深入了解 Notch 信號水平是如何隨著乳腺癌治療反應和治療結果而改變的，作者首先分析了 PROMIX 試驗的數據。在接受兩個周期的表柔比星和多西他賽治療后，有放射學證據顯示有殘留疾病的患者子集中，有配對活檢供轉錄組學分析，TNBC 患者組的特征得分（ssGSEA）在治療后增加（圖6A），Luminal B組有一定程度的升高，而Luminal A患者組無升高。此外，TNBC 患者的 Notch 特征基線（即治療開始前）最高（圖6A），這與圖5中的結果一致?；€Notch特征得分較低的患者比Notch特征得分較高的患者顯示出更好的無病生存期（DFS）趨勢（圖6B），Notch核心特征也是如此。與沒有淋巴結轉移的患者相比，有淋巴結轉移的患者在治療前原發(fā)腫瘤的特征得分較低（圖6C）。

圖6 PROMIX乳腺癌隊列中20個基因標記評分分析

接下來，研究了前瞻性乳腺癌基因組指導治療研究（BEAUTY）中Notch信號對治療的響應水平。通過GSVA評估，基線 TNBC 亞型的 20 個基因特征得分最高，其次是 Luminal A、HER2 + 和 Luminal B 亞型（圖7A）。比較基線和手術時的 GSVA，HER2+、Luminal A 和 Luminal B 患者的 GSVA 值增加，而 TNBC 組的 GSVA 值減少（圖7B）。在分析 TNBC 組治療應答者與非應答者治療前的 GSVA 特征評分時，非應答者組在治療開始前的 GSVA 值更高（圖7C）。

綜合來看，PROMIX 和 BEAUTY 隊列的數據表明，TNBC 腫瘤在治療前的 Notch 信號水平較高，在某些情況下，化療可能會誘導 Notch 信號的增加，盡管 TNBC 和 Luminal A 患者在這方面的結果在兩個隊列中有所不同。數據普遍表明，基線Notch信號的升高可能與預后有關，因為在PROMIX隊列中，Notch信號的升高與較差的無病生存期有關。此外，在BEAUTY隊列中，TNBC患者和NAC后殘留疾病患者在治療前腫瘤中的Notch信號得分較高。

圖7 BEAUTY乳腺癌隊列中20個基因特征評分分析

實驗方法：

細胞培養(yǎng)，Notch信號的激活和阻斷，qRT-PCR，RNA測序，生物信息學分析，TCGA BRCA隊列中Notch突變狀態(tài)的特征評分分析，PROMIX和BEAUTY患者的研究

參考文獻：

Braune EB, Geist F, Tang X, Kalari K, Boughey J, Wang L, Leon-Ferre RA, D'Assoro AB, Ingle JN, Goetz MP, Kreis J, Wang K, Foukakis T, Seshire A, Wienke D, Lendahl U. Identification of a Notch transcriptomic signature for breast cancer. Breast Cancer Res. 2024 Jan 3;26(1):4. doi: 10.1186/s13058-023-01757-7.