藥理激活GPX4可改善多柔比星誘發(fā)的心肌病

         由于多柔比星（DOX）具有心臟毒性，其臨床應(yīng)用受到限制。過量亞鐵引起的脂質(zhì)過氧化被認(rèn)為是 DOX 誘導(dǎo)的心肌?。?span>DIC）的關(guān)鍵分子機制。單核RNA 測序（snRNA-seq）分析發(fā)現(xiàn)了易受 DOX 誘導(dǎo)的鐵死亡影響的心肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞。谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）激活劑硒甲硫氨酸（SeMet）能顯著降低體外多不飽和脂肪酸（PUFA）和氧化脂質(zhì)水平。SeMet 能明顯降低 DOX 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和 C57BL/6 小鼠的死亡率。值得注意的是，SeMet 能在使用DOX的乳腺癌模型中發(fā)揮抗腫瘤作用，同時還能為同一動物提供心臟保護(hù)，且不會產(chǎn)生可檢測到的毒性。這些發(fā)現(xiàn)表明，藥理激活 GPX4 是預(yù)防多柔比星心臟毒性的一種有價值、有前景的策略。該研究于2024年1月發(fā)表在《Redox Biology》，IF：11.4。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. DIC中心肌細(xì)胞的單細(xì)胞特征

        對DOX治療小鼠（DOX 20 mg/kg，n = 3）和未治療小鼠（n = 3）的心臟樣本進(jìn)行單核RNA測序（snRNA-seq）（圖1a）。通過無偏聚類分析確定并可視化了 32 個聚類，其中包括 12 種不同的細(xì)胞類型（圖 1b）。通過檢測心肌細(xì)胞（Ryr2、Trdn、Myh7、Myh6、Ttn）、成纖維細(xì)胞（Pdgfra、Ckap4、Col1a1）、內(nèi)皮細(xì)胞（Pec1a1、Pec2a1、Pec3a1、Pec4a1、Pec5a1、Pec6a1、Pec7a1、Pec6a1、Ttn）中已知品系標(biāo)志物的表達(dá)，確定了五個非免疫性心臟細(xì)胞群、 內(nèi)皮細(xì)胞（Pecam1、Vwf、Cdh5、Cd93、Ldb2、Tie1）、脂肪細(xì)胞（Plin1、Pparg、Adam12）、平滑肌細(xì)胞（Acta2、Tagln、Myh11）、上皮細(xì)胞（Wt1、Tbx18、Krt18、Msln）和周細(xì)胞（Pdprb）（圖 1c）。與 DOX 相關(guān)的心臟毒性研究大多基于心肌細(xì)胞。通過無監(jiān)督降維和聚類確定了四個表現(xiàn)出不同基因表達(dá)譜的心肌細(xì)胞亞群（圖 1c）。

        比較兩組心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜和通路富集情況，發(fā)現(xiàn)在 DOX 治療后，肥厚型心肌病、擴張型心肌病、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌收縮、致心律失常性右室心肌病和鐵蛋白沉積通路顯著富集（圖 2a）。進(jìn)一步檢測之前報道過的與鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，證實經(jīng) DOX 處理后，與鐵死亡相關(guān)的基因如 Gclm（谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞基）、Fth1（鐵蛋白重鏈 1）、Hmox1（血紅素加氧酶-1）、Slc39a14（溶質(zhì)運載家族 39 成員 14）、Ftl1（鐵蛋白輕多肽 1）、Nqo1（NAD（P）H醌氧化還原酶 1）、Cp（腦磷脂蛋白）、Slc39a8（溶質(zhì)運載家族39成員8）、Map1lc3b（微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 beta）和Ncoa4（核受體輔激活劑4）在心肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖 2b-g）。綜上所述，snRNA-seq 分析確定心肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞是導(dǎo)致 DOX 誘導(dǎo)的鐵死亡的主要特異性細(xì)胞類型。

圖1. 多柔比星治療期間心肌細(xì)胞的單核表達(dá)

2. SeMet通過抑制脂質(zhì)過氧化改善DIC

        谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）是一種硒蛋白，它通過抑制不飽和脂肪的過氧化作用而在鐵躍遷過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，補硒可提高 GPX4 的活性。假設(shè)藥物激活 GPX4 可預(yù)防 DOX 引起的心臟損傷。測試5 種硒化合物，發(fā)現(xiàn)在急性 DOX 模型中，硒蛋氨酸（SeMet）對 DIC 的保護(hù)作用最強（圖 2h）。與單用 DOX 14 天無存活率相比，補充 SeMet 可使存活率提高 60%（圖 2h）。用較低劑量的 DOX（15 毫克/千克）進(jìn)行存活實驗。值得注意的是，各組之間存在顯著差異，這表明 DIC 涉及鐵死亡，而 SeMet 比鐵前列素-1 和 DXZ 具有更好的心臟保護(hù)作用（圖 2i）。此外，SeMet 能顯著抑制 DOX 誘導(dǎo)的血液中心臟生物標(biāo)志物的增加（圖 2j）。進(jìn)一步評估補充 SeMet 是否能減輕 DOX 誘導(dǎo)的 H9C2 細(xì)胞鐵死亡反應(yīng)。在H9C2細(xì)胞模型中，鐵死亡抑制劑ferrostatin-1可挽救 DOX 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。同樣，SeMet可以減少 DOX 誘導(dǎo)的 H9C2 細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化（圖 2k-m）。

        為進(jìn)一步探索 SeMet 抑制脂質(zhì)過氧化的機制，評估作為過氧化底物的 PUFAs 的水平。與藥物對照組相比，補充 SeMet 能明顯降低 H9C2 心肌細(xì)胞中七種 PUFAs（C18:3N6、C20:3N6、C20:4、C22:4、C22:5N3）的水平（圖 2n-q）。DIC 導(dǎo)致擴張型心肌病和心力衰竭。DIC 可導(dǎo)致擴張型心肌病和心力衰竭。停止使用 DOX 后，心室功能趨于正常，左室射血分?jǐn)?shù)（EF）和縮短分?jǐn)?shù)（FS）是評估 DOX 心臟毒性的最佳參數(shù)。根據(jù) DOX 治療四周后測量的心臟收縮功能，在另一個模型中持續(xù)觀察到了心臟保護(hù)作用（圖 3a-d）。值得注意的是，SeMet治療還能顯著阻止小鼠心臟組織在DOX給藥后的纖維化（圖3e和f）。在本報告中發(fā)現(xiàn) SeMet 處理對線粒體功能和呼吸鏈復(fù)合物細(xì)胞通路有廣泛影響（圖 3g）。此外，與載體處理相比，DOX 處理會導(dǎo)致更多的 JC-1 單體，而補充 SeMet 則會顯著降低這種 DOX 誘導(dǎo)的效應(yīng)（圖 3h）?？傊?，這些結(jié)果表明，SeMet 有可能抑制 DOX 誘導(dǎo)的鐵死亡并改善 DOX 誘導(dǎo)的心肌病。

圖2. 鐵死亡與DOX誘導(dǎo)的心臟毒性相關(guān)

圖3. GPX4的藥理激活保護(hù)小鼠免受DOX誘導(dǎo)的心臟毒性

3. SeMet的保護(hù)作用依賴于GPX4

        為研究 SeMet 對心臟的保護(hù)作用是否依賴于 GPX4，產(chǎn)生雜合子 GPX4 基因敲除（GPX4hetko）小鼠，以評估 GPX4 對小鼠心臟形態(tài)學(xué)、心臟功能和電生理學(xué)的影響。與 GPX4wt 小鼠相比，雜合消融 GPX4 對心臟形態(tài)和功能（包括 EF 和 FS）的影響微乎其微（圖 4a-d）。

        為進(jìn)一步驗證 SeMet 是否以 GPX4 依賴性方式降低 DOX 誘導(dǎo)的心臟毒性，給雄性野生型小鼠和 GPX4hetko 小鼠注射單次高劑量 DOX。存活率分析表明，與對照組相比，GPX4 激活劑 SeMet 的預(yù)處理顯著降低DOX 誘導(dǎo)的死亡率，而這種效應(yīng)依賴于 GPX4 的表達(dá)（圖 4e）。為證實 GPX4 在維持小鼠心臟組織脂質(zhì)代謝平衡中的作用，進(jìn)行非靶向脂質(zhì)體分析以確定 GPX4wt 和 GPX4hetko 小鼠心臟組織中不同的代謝物。代謝組學(xué)分析清楚地將 GPX4hetko 樣品與 WT 樣品區(qū)分開來，表明 GPX4 缺乏導(dǎo)致心臟脂質(zhì)代謝發(fā)生了全面變化（圖 4f）。脂質(zhì)組學(xué)分析顯示，GPX4缺乏顯著增加了52種PUFA的水平，包括PC (17:0_20:4)， PC (17:0_22:6)， PC (18:2_20:4)， PC (19:1_18:2)， PC (19:1_22:6)， PC (40:7e)， PE (14:1e_18:2)， PE (18:1_20:2)， PI (17:0_20:4)， PI (18:0_18:2)， PI (18:0_20:4)， PG(20:3-20:4)，神經(jīng)酰胺和甘油三酯(圖4 g- n)。綜上所述，SeMet是GPX4的激活劑，介導(dǎo)心臟內(nèi)PUFA水平，并在GPX4存在的情況下具有抑制DIC的能力。

圖4. SeMet的心臟保護(hù)作用依賴于GPX4

4. SeMet不影響DOX的化療效果

        從理論上講，預(yù)防 DIC 的理想藥物不應(yīng)影響 DOX 的抗腫瘤療效。在 4T1 乳腺癌細(xì)胞模型中，SeMet 和 DOX 的聯(lián)合用藥在體內(nèi)表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果（圖 5a）。SeMet 不會降低 DOX 和順鉑的抗腫瘤效率，與單獨使用 SeMet 或 DOX 相比，SeMet 和 DOX 的聯(lián)合療法取得了更好的抗腫瘤效果（圖 5b）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，SeMet 可以預(yù)防心肌病，而不會影響 DOX 的抗腫瘤療效和其他不良反應(yīng)。

5. SeMet減少乳腺癌患者的心肌酶

        使用一種富含硒（Se）的牡蠣蘑菇作為補充 Se 的資源。經(jīng)電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）證實，這種蘑菇中硒的主要形式是SeMet。使用根據(jù) SeMet 計算出的不同濃度的富含硒的杏鮑菇，以達(dá)到有效劑量范圍，從而防止 DIC。與之前的結(jié)果（圖 2h）一致，蘑菇中 1.5 mg/kg SeMet 的保護(hù)效果最高（圖 5c）。使用富含 Se 的杏鮑菇片和作為安慰劑的杏鮑菇片進(jìn)行了一項探索性試驗（ChiCTR2200056796）。在臨床試驗中，根據(jù)人鼠轉(zhuǎn)換率，Se 的劑量為 300 微克/天。6 名乳腺癌 II 期術(shù)后患者參加了研究，并隨機接受安慰劑（杏鮑菇片，n = 3）或富含 Se 的杏鮑菇片（每天 300 μg SeMet）（n = 3）（圖 6a）。所有入選患者在手術(shù)前均未接受化療或放療，而是接受了四個周期的 AC 方案（劑量為 60 毫克/平方米的多柔比星和劑量為 600 毫克/平方米的環(huán)磷酰胺）作為輔助治療。在開始化療前 3 天，患者開始服用為期 7 天的富含硒的杏鮑菇片/安慰劑。化療后第二和第三天檢測心肌酶水平。靶向代謝分析表明，富含 Se 的杏鮑菇在第二次 AC 治療后降低 12-HEPE、14-HDHA 和 13-HODE 的水平，但安慰劑組和 Se 補充劑組之間沒有顯著差異（圖 6b）。值得注意的是，服用富含 Se 的杏鮑菇能有效降低心臟損傷的血清標(biāo)志物，包括 CK-MB 和 MYO（圖 6c）。有趣的是，與之前的研究一致，補充 Se 有減少化療后血小板和血紅蛋白下降的趨勢（圖 6d）。

圖5. SeMet增強DOX的抗腫瘤活性

圖6. SeMet減少乳腺癌患者的心肌酶

結(jié)論

        綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SeMet能以GPX4依賴性方式抑制DOX誘導(dǎo)的鐵死亡，而且不會影響化療的療效。這種制劑可能是一種很有前景的預(yù)防 DIC 的治療方法。

實驗方法：

        體內(nèi)多柔比星治療，小鼠心功能超聲心動圖，小鼠心電圖，小鼠電生理學(xué)，4T1乳腺癌異種移植小鼠模型，細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞活力測定，共聚焦成像，線粒體膜電位分析(ΔΨm)，轉(zhuǎn)錄組分析，單細(xì)胞去核和單核（snRNA）-seq文庫制備，單核RNA測序數(shù)據(jù)處理，血清cTnT、CK-MB和MYO活性測定，組織學(xué)和免疫組化，免疫熒光，脂質(zhì)體分析

參考文獻(xiàn)

        Huang C, Guo Y, Li T, Sun G, Yang J, Wang Y, Xiang Y, Wang L, Jin M, Li J, Zhou Y, Han B, Huang R, Qiu J, Tan Y, Hu J, Wei Y, Wu B, Mao Y, Lei L, Song X, Li S, Wang Y, Zhang T. Pharmacological activation of GPX4 ameliorates doxorubicin-induced cardiomyopathy. Redox Biol. 2024 Apr;70:103024. doi: 10.1016/j.redox.2023.103024. Epub 2024 Jan 10. PMID: 38232458; PMCID: PMC10827549.