METTL16的乳酸化通過對FDX1 mRNA進行m6A修飾在胃癌中促進銅死亡

          銅死亡（cuproptosis）是由銅離子濃度過高引起的一種現(xiàn)象，被緊急地開發(fā)為潛在的癌癥治療方法。然而，腫瘤中銅死亡的啟動、傳播和最終執(zhí)行機制尚不清楚。在這項研究中，作者發(fā)現(xiàn)在胃癌（GC）中，特別是在惡性腫瘤中，銅含量顯著升高。篩選發(fā)現(xiàn)，METTL16，一種非典型的甲基轉移酶，通過對FDX1 mRNA進行m6A修飾，在銅死亡中起著關鍵的調節(jié)作用。此外，銅應激促進METTL16在K229位點的乳酸化，隨后引發(fā)銅死亡。METTL16的乳酸化過程受SIRT2的抑制。提高的METTL16乳酸化顯著提高了銅離子載體elesclomol的治療效果。將elesclomol與SIRT2特異性抑制劑AGK2結合使用，在體內外誘導了胃腫瘤的銅死亡。這些結果揭示了非組蛋白蛋白質METTL16乳酸化對腫瘤中銅死亡的重要性。鑒于GC中銅和乳酸濃度較高，誘導銅死亡成為一種有前景的GC治療策略。該研究于2023年10月發(fā)表于《Nature Communications》上，題為“Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer”，影響因子16.6。

技術路線

研究方法

1.  胃癌中銅含量較高并與腫瘤進展相關

          銅死亡是由過高的銅濃度引起的，但腫瘤中銅死亡的調控機制仍需進一步探討。鑒于銅主要通過胃和上消化道吸收，因此，胃腸系統(tǒng)腫瘤適合研究銅死亡的啟動和傳播。作者分析了48對胃癌組織和相鄰組織中的銅濃度，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的銅濃度高于正常胃組織（圖1a，P < 0.01）。進一步分析顯示，III期胃癌患者中的相對銅含量高于I期和II期胃癌患者（圖1b，P < 0.05），表明銅含量與腫瘤進展相關。此外，銅含量與胃癌患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）呈負相關（圖1c, d; log-rank P < 0.05）。同時，銅含量與細胞增殖指標Ki-67的表達呈正相關（圖1e）。同樣，患者血清標本中的銅含量與血小板/淋巴細胞比值和中性粒細胞/淋巴細胞比值呈正相關，這兩者都是與胃癌侵襲性惡性腫瘤相關的炎癥預后生物標志（圖1f, g)。這些結果表明高銅含量參與了胃癌的進展和發(fā)展。

          此外，作者對不同類型的胃癌，特別是惡性腫瘤類型中銅濃度的差異進行了研究。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)粘液腺癌的銅濃度高于總體胃腫瘤（圖1h）。在粘液腺癌中，銅含量與淋巴結轉移（圖1i）和血管侵襲（圖1j）等侵襲指標呈正相關。然而，在非粘液腺癌中，銅含量與這些侵襲指標或腫瘤分化無顯著相關性。粘液腺癌是胃癌的一種罕見組織學亞型，與更晚期和較差的5年總生存期和無病生存期相關39。作為難治性胃癌，粘液腺癌以化療放療耐藥性為特征，迫切需要更有效的治療方法。

          最近，研究人員發(fā)現(xiàn)高胞內銅濃度會觸發(fā)一種還原酶FDX1將Cu2+還原為更具毒性的Cu1+，導致銅死亡11。作者發(fā)現(xiàn)與正常胃組織相比，胃癌中FDX1蛋白水平較高（圖1k）。考慮到胃癌中FDX1蛋白水平和銅含量都較高，銅死亡可能更容易被觸發(fā)。這為胃癌提供了潛在的治療策略，特別是對于惡性腫瘤——粘液腺癌。

圖1 胃癌中銅含量較高并與腫瘤進展相關。

2.  METTL16是銅死亡的重要介導因子

          已經報道與良性胃疾病和健康對照組相比，胃癌組中總m6A水平顯著增加，并促進了胃癌的腫瘤發(fā)生、生長、侵襲、上皮間質轉化（EMT）、轉移，甚至多藥耐藥過程。此外，m6A修飾參與了幾種細胞死亡類型，包括凋亡、壞死, 鐵死亡和火死亡。然而，m6A修飾與銅死亡之間的關系仍不明確。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)胃癌組織中銅含量與總m6A水平呈正相關（R = 0.5116）。此外，銅顯著上調了胃癌細胞中總m6A修飾水平。鑒于甲基轉移酶樣蛋白（METTL）家族在促進m6A修飾中起主導作用，作者分析了METTLs敲除細胞在以1:1比例處理elesclomol/disulfiram和銅時的存活率。結果表明，METTL16敲除導致對elesclomol/disulfiram-Cu治療的耐藥性。此外，使用硫代硫氧鉬酸銅（TTM），一種銅死亡抑制劑，抑制了對照組和METTL16敲除細胞中的銅死亡，表明METTL16參與了銅死亡。為了進一步驗證這些結果，成功構建并驗證了METTL16敲除克隆細胞系，觀察到了與METTL16敲除細胞相似的結果。這些結果表明METTL16在銅死亡中發(fā)揮著至關重要的作用。

圖2 METTL16是銅死亡的重要介導因子

          METTL16是一種m6A甲基轉移酶，可以修飾多種前序和非編碼RNA，促進翻譯和癌變，并且是癌癥治療的一個重要潛在靶點。通過TCGA和GTEx數據庫的分析發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中METTL16的mRNA水平相對較高，而在腫瘤周圍組織中較低。免疫組化（IHC）評分結果也顯示，胃癌組織中METTL16蛋白水平顯著高于正常胃組織。此外，METTL16蛋白水平與TNM分期、病理模式、神經侵襲或血管侵襲無關。有趣的是，高METTL16蛋白水平的胃癌患者的總生存期（OS）和無復發(fā)生存期（DFS）顯著增加，這與之前的研究結果一致，暗示高METTL16蛋白水平對腫瘤具有潛在的毒性作用。

3.  METTL16通過靶向FDX1促進了銅死亡

          METTL16負責在許多轉錄本中進行m6A沉積。因此，作者對穩(wěn)定的對照-Sh和METTL16-Sh細胞系進行了甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）測序（圖3a）。MeRIP-seq的metagene圖顯示，在METTL16-Sh細胞中m6A含量減少。使用HOMER軟件預測了每個樣本中潛在的m6A修飾，并發(fā)現(xiàn)m6A修飾主要映射到經典的GGAC基序（圖3b）。作者進一步分析了根據MeRIP-seq結果mRNA的總m6A分布模式，發(fā)現(xiàn)m6A峰主要富集在CDS和3'UTR區(qū)域。KEGG通路分析表明，被METTL16甲基化的基因主要與癌癥通路相關。GO富集分析顯示，被METTL16修飾的基因富集了與線粒體通路相關的前15個通路（圖3c）。此外，作者鑒定了10個與銅死亡相關通路的典型因子，這些因子與低m6A甲基化水平以及METTL16-Sh組中下調的mRNA水平相關（圖3d）。qPCR分析顯示，METTL16-sh細胞中FDX1、MTF1、PDHB、ATP7A和DLD的mRNA水平下調，其中FDX1在METTL16-sh細胞中表現(xiàn)出最顯著的mRNA水平下調（圖3e）。此外，在METTL16-Sh或-KO細胞中檢測到FDX1蛋白水平的顯著下調（圖3f,g）。考慮到FDX1是銅離子載體誘導的細胞死亡的關鍵調節(jié)因子，作者推測METTL16誘導的銅死亡依賴于FDX1。

          接下來，作者評估了METTL16是否通過影響FDX1的表達來調控銅死亡。鑒于蛋白質硫辛酸化是銅死亡的關鍵元素，作者評估了METTL16敲除對蛋白質硫辛酸化的影響，使用硫辛酸特異性抗體作為DLAT硫辛酸化的測量標準。結果顯示，METTL16敲除導致DLAT硫辛酸化減少，通過免疫印跡進行測量（圖3h）。此外，在elesclomol/disulfiram-Cu處理后，FDX1過表達逆轉了METTL16敲除和敲除細胞系中銅死亡的拮抗作用（圖3i, j）。METTL16過表達誘導的銅死亡通過FDX1敲除得到抑制（圖3k）。總體而言，這些數據表明，METTL16通過靶向FDX1促進了銅死亡的發(fā)生。

圖3 METTL16通過靶向FDX1促進了銅死亡的發(fā)生

4.  METTL16通過m6A修飾在FDX1 mRNA上促進FDX1蛋白的積累

          為進一步探索METTL16如何調控m6A修飾并影響FDX1 mRNA水平，進行了基因特異性MeRIP-qPCR實驗。作者發(fā)現(xiàn)，在METTL16敲除和敲除細胞中，FDX1 mRNA上的m6A水平顯著降低，而在轉染METTL16過表達質粒的細胞中顯著增加（圖4a, b）。當用放線菌D（ActD）停止轉錄時，FDX1 mRNA在METTL16敲除細胞中的降解速率比對照細胞更快（圖4c）。已有報道指出，METTL16位于細胞質促進mRNA翻譯，并位于細胞核將m6A沉積到特定RNA靶標29。內源METTL16位于GC腫瘤細胞核中。這些結果表明，METTL16介導的甲基化導致FDX1 mRNA穩(wěn)定。對FDX1富集m6A峰的IGV分析顯示，與對照細胞（紅色峰）相比，METTL16-siRNA細胞（綠色峰）中FDX1的m6A水平降低，表明METTL16可能促進FDX1的CDS或3'UTR區(qū)域的m6A修飾（圖4d）。因此，選取部分CDS區(qū)域（選擇區(qū)域：110456920-110457047和110462353-110462468）以及3'UTR區(qū)域（選擇區(qū)域：110462469-110464884）的FDX1與pGL3熒光素酶報告基因構建FDX1-WT熒光素酶報告基因。共轉染FDX1熒光素酶報告基因和不同劑量的METTL16-OE質粒后，發(fā)現(xiàn)METTL16顯著促進了FDX1-熒光素酶活性（圖4e）。

圖4 METTL16通過在FDX1 mRNA上進行m6A修飾促進FDX1蛋白的積累。

          為進一步探索，作者使用基于序列的m6A修飾位點預測器SRAMP，在FDX1 mRNA上預測了可能的m6A修飾位點。結合預測結果和圖4e中的數據，作者確定了兩個潛在的m6A修飾位點，具有非常高的置信度：FDX1轉錄本的CDS區(qū)域中的602?A位點和UTR區(qū)域中的820?A位點（圖4f，g）。隨后進行了MeRIP-qPCR分析，使用特定引物證明FDX1轉錄本上的602位點是METTL16介導的甲基化的直接底物（圖4h）。此外，作者設計并構建了FDX1-602-Mut和FDX1-820-Mut熒光素報告基因，通過將m6A基序中的特定腺嘌呤（A）替換為胸腺嘧啶（T），基于FDX1-WT熒光素報告基因（圖4g）。雙熒光素檢測結果表明，METTL16無法促進攜帶602位點突變的FDX1-CDS/UTR熒光素報告基因的熒光素活性（圖4i）。在GEPIA數據庫中對METTL16和FDX1的表達進行分析顯示，它們在GC中呈正相關（圖4j）。另外，免疫組化染色表明，在包含54對GC和相鄰正常組織的組織微陣列中，METTL16的表達與FDX1的表達呈正相關（圖4k）。這些結果證實了METTL16介導的對FDX1 mRNA的m6A修飾對FDX1 mRNA的穩(wěn)定性至關重要。

5.  METTL16在銅脅迫下發(fā)生K229位點的乳酸化

          接下來，作者評估了METTL16在GC中是否對銅脅迫作出反應。在銅處理過程中，METTL16的mRNA和蛋白水平保持不變，但FDX1的蛋白水平顯著增加（圖5a，b）。為驗證在銅脅迫下FDX1表達的上調是否依賴于METTL16，作者測量了METTL16敲低或敲除細胞中在有無銅的情況下FDX1蛋白的表達。結果表明，METTL16缺乏阻斷了銅誘導的FDX1上調（圖5c，d）。由于在銅脅迫下METTL16的mRNA和蛋白水平保持不變，作者隨后使用質譜分析測量了METTL16的PTM變化。分析顯示METTL16蛋白序列上有十一個乳酸化位點和兩個乙?；稽c（圖5e）。在乳酸處理后，這六個乳酸化（紅色）位點的PTM水平顯著增加，暗示這六個位點在腫瘤細胞中可能受到調節(jié)。作者隨后確認了乳酸化或乙?；瘜︺~脅迫的響應。結果顯示，銅處理顯著增加了METTL16的乳酸化水平而非乙酰化水平（圖5f）。為了確定METTL16在與銅相關的代謝中的重要乳酸化位點，作者生成了這六個乳酸化位點和K410（作為代表性位點，在乳酸脅迫下乳酸化水平未發(fā)生變化）的乳酸化缺陷突變體（K到R）。作者發(fā)現(xiàn)只有METTL16-K229R突變體在銅脅迫下顯示減少的乳酸化（圖5g）。隨后，通過LC-MS/MS分析展示了METTL16-K229及其他乳酸化位點的b-y離子匹配圖（圖5e，圖5h）。為進一步確認在銅脅迫下METTL16-K229的乳酸化，作者生成了METTL16 lacty-K229抗體，并使用lacty-K229肽和表達METTL16-WT、-K229R或-K229E的細胞驗證了其效力和特異性（圖5i，j）。銅和乳酸處理均誘導了METTL16在K229處的強烈乳酸化（圖5k，l），表明K229是銅相關代謝中的一個重要乳酸化位點。這些結果表明，在銅脅迫下METTL16在K229位點發(fā)生乳酸化。

圖5 在銅脅迫下，METTL16在K229位點發(fā)生乳酸化。

          然后，作者分析了K229乳酸化對METTL16的潛在影響。首先，METTL16-K229乳酸化不影響METTL16的核定位。METTL16與MAT2A RNA發(fā)夾復合物的晶體結構（PDB 6DU5）顯示，K229與E226形成了鹽橋，而自我抑制環(huán)路中的K163（粉色）插入了METTL16的SAM結合位點。作者的結構建模表明，R230可以通過與環(huán)路的K163或Q162形成氫鍵來穩(wěn)定自我抑制狀態(tài)。K229的乳酸化將廢除其與E226的鹽橋，這可能導致E226側鏈的構象變化，并允許與R230形成鹽橋。這將削弱自我抑制狀態(tài)的穩(wěn)定性，導致METTL16的酶活性升高。接著，作者選擇了METTL16的下游靶標，如BCAT1、BCAT2和GPX451來驗證METTL16-K229乳酸化對其甲基轉移酶活性的影響。結果顯示，METTL16-K229E促進了甲基轉移酶活性。在穩(wěn)定的METTL16-恢復細胞系中進一步確保FDX1蛋白水平，其中內源性METTL16被野生型（WT）、乳酸化缺陷型（K229R）或乳酸化模擬型（K229E）所替代。結果顯示，在METTL16敲除細胞中FDX1蛋白水平下降，在METTL16-WT或-K229E恢復細胞中恢復，但在METTL16-K229R恢復細胞中沒有恢復（圖5m）。綜上所述，METTL16-K229乳酸化是由銅脅迫誘導的，并促進了METTL16的甲基轉移酶活性。

6.  SIRT2去乳酸化METTL16-K229并抑制METTL16的活性

          以上數據證實了銅激活了METTL16-K229的乳酸化，但腫瘤細胞中涉及的特定去乳酸化酶和乳酸化酶仍不清楚。從理論上講，乳酸含量越高，可用的乳酸酸就越多，增加蛋白質的乳酸化。因此，作者使用乳酸含量檢測試劑盒檢測了銅處理的GC細胞內乳酸含量，并發(fā)現(xiàn)銅處理后沒有顯著差異。然后，作者調查銅是否介導了對METTL16的乳酸轉移酶或去乳酸酶的調節(jié)。進行LC-MS/MS分析以確定METTL16的結合蛋白。作為METTL16的結合蛋白，SIRT2是經典的去乙酰化酶，被分類為主要的去乳酸酶和乳酸轉移酶組（圖6a）。EIF3b也被確定為METTL16的結合蛋白，與先前的研究結果一致。為了調查和驗證METTL16與SIRT2之間的相互作用，作者在HGC-27細胞中檢測了METTL16-SIRT2的結合（圖6b）。直接METTL16-SIRT2的結合通過His-pull-down實驗得到驗證。METTL16-K229乳酸化受SIRT2過表達明顯抑制，受SIRT2沉默或SIRT2抑制劑AGK2處理促進。此外，銅誘導的METTL16-K229的乳酸化被SIRT2過表達抑制，而被SIRT2沉默或AGK2處理增加。總的來說，這些結果表明，SIRT2與METTL16在K229位點相互作用并對其進行去乳酸化。

圖6 SIRT2去乙酰化METTL16-K229并抑制METTL16的活性。

          作者進一步探討了SIRT2對穩(wěn)定的METTL16恢復表達細胞系（METTL16-WT、-K229R或-K229E）的調控作用。SIRT2過表達抑制了METTL16-WT細胞中FDX1的m6A水平，但不影響METTL16-K229R或-K229E細胞，表明SIRT2通過METTL16-K229乳酰化抑制了METTL16的活性（圖6h，i）。此外，SIRT2過表達抑制了FDX1蛋白水平（圖6j），而SIRT2沉默和AGK2處理促進了FDX1蛋白水平（圖6k）。免疫熒光染色（IF）的結果表明，在胃癌組織微陣列中，SIRT2蛋白水平與FDX1蛋白水平呈負相關（圖6l）。另外，作為去乙?；傅?span>SIRT2也可能調節(jié)了METTL16的去乙?；Ｗ髡甙l(fā)現(xiàn)，在SIRT2過表達后，總的METTL16乙?；兴鶞p少。為了檢驗SIRT2介導的METTL16去乙?；欠裼绊?span>METTL16的甲基轉移酶活性，作者產生了具有METTL16-Sh恢復的METTL16-WT、-K171R、-K171Q、-K348R和-K348Q的細胞，并進行了m6A水平檢測。結果顯示，去乙?；稽c對METTL16的甲基轉移酶活性沒有影響。此外，在METTL16-WT、-K171R、-K171Q、-K348R和-K348Q過表達后，FDX1 mRNA水平的增加沒有顯著差異。這些數據表明，SIRT2介導的METTL16去乙?；⒉挥绊?span>FDX1 mRNA水平。在SIRT2敲除或AGK2處理下，METTL16的表達與否沒有顯著差異。綜上所述，這些結果表明，SIRT2通過在K229位點進行去乳酰化來負向調節(jié)METTL16的活性。

          為了進一步探討銅離子對SIRT2對METTL16的調控作用，作者檢測了銅離子是否影響SIRT2和METTL16的相互作用。令人意外的是，結果顯示銅處理略微減少了SIRT2和METTL16的結合?？紤]到在銅離子處理下METTL16的乳?；黾樱髡哂欣碛赏茰y銅離子處理可能增強了METTL16和乳?；D移酶的結合。

7.  SIRT2-METTL16-FDX1-銅離子誘導的細胞凋亡軸支持一種有前景的治療策略

          FDX1是銅離子誘導的細胞凋亡的重要介體，這是一種治療癌癥的潛在方法。作者發(fā)現(xiàn)，在SIRT2抑制或銅誘導的METTL16-K229乳酰化后，FDX1蛋白水平增加。接下來，作者檢查了METTL16-K229乳?；瘜︺~離子誘導的細胞凋亡的影響。結果顯示，在銅應激條件下，METTL16敲除導致的DLAT硫辛?；皆?span>METTL16-WT/-K229E細胞中得到了恢復，但在METTL16-K229R細胞中未能實現(xiàn)（圖7a）。此外，在銅離子和elesclomol處理條件下，METTL16-WT或-K229E細胞誘導了細胞凋亡，但METTL16-K229R細胞未見此效應（圖7b）。此外，SIRT2過表達逆轉了METTL16-WT在銅應激條件下所誘導的DLAT硫辛?；黾樱话?span>METT16-K229E，表明SIRT2通過去乳酰化METTL16-K229抑制了細胞凋亡（圖7c）。一致地，AGK2處理促進了在銅應激條件下METTL16-WT細胞中的DLAT硫辛?；?span>METTL16-K229R細胞中未見此效應（圖7d）。此外，在elesclomol和銅離子存在的情況下，AGK2處理促進了細胞凋亡（圖7e）。

圖7 SIRT2-METTL16-FDX1-銅凋亡軸支持一種有前景的治療策略。

          作者進一步評估了METTL16的乳酸化是否可以增強接受elesclomol治療的小鼠異種移植腫瘤的治療反應。METTL16-WT、-K229R和-K229E細胞被皮下注射到裸鼠的左右后腿上方。觀察到在接受elesclomol治療的小鼠中，METTL16-WT和-K229E組的腫瘤生長明顯受到抑制，但在METTL16-K229R組中未觀察到這種情況，表現(xiàn)為腫瘤體積和重量的減少（圖7f–h）。

          腫瘤切片中的FDX1染色顯示，在腫瘤異種移植中，METTL16-WT和-K229E組中的FDX1染色較METTL16-K229R組更高（圖7i）。這些結果表明，在K229位點的METTL16的乳酸化狀態(tài)在決定銅凋亡中發(fā)揮了至關重要的作用。此外，在腫瘤異種移植中采用了elesclomol和AGK2的聯(lián)合治療。腫瘤切片的分析顯示，在體內AGK2增強了elesclomol的治療效果，表現(xiàn)為腫瘤體積和重量的減少（圖7j–l）。這些結果表明elesclomol和AGK2的聯(lián)合治療在胃癌中是一種有前景的治療方法，特別適用于惡性腫瘤——粘液腺癌（銅含量較高）。

實驗方法

          細胞培養(yǎng)；小鼠異種移植腫瘤實驗；RNA提取和實時熒光定量聚合酶反應（qRT-PCR）；熒光素酶報告基因檢測；蛋白質印跡；His pull-down 檢測；點突變構建；shRNA/siRNA設計和構建；銅微孔板測定；免疫沉淀 （IP）；免疫熒光染色；MeRIP-qPCR酶；甲基化 RNA 免疫沉淀測序 （MeRIP-seq）；RNA 免疫沉淀 （RIP） 檢測；RNA穩(wěn)定性測定；CRISPR/Cas9敲除細胞系；體外乳?；囼灒簧镄畔W分析

參考文獻

          Sun L, Zhang Y, Yang B, Sun S, Zhang P, Luo Z, Feng T, Cui Z, Zhu T, Li Y, Qiu Z, Fan G, Huang C. Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 2023 Oct 20;14(1):6523.