腸道微生物代謝物通過抑制鐵死亡促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展

腸道菌群在人體健康中起著關(guān)鍵作用。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，腸道微生物通過產(chǎn)生致癌代謝物參與腫瘤發(fā)生的進(jìn)展。然而，潛在的分子機(jī)制在很大程度上是未知的。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)從厭氧菌胃鏈球菌中提取的色氨酸代謝物，反式-3-吲哚丙烯酸（IDA），促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。在機(jī)制上，IDA作為芳烴受體（AHR）的內(nèi)源性配體，轉(zhuǎn)錄上調(diào)ALDH1A3（醛脫氫酶1家族成員A3）的表達(dá)，ALDH1A3利用視網(wǎng)膜作為底物產(chǎn)生NADH， NADH是鐵氧化抑制蛋白1（FSP1）介導(dǎo)的還原性輔酶Q10合成所必需的。在體外和體內(nèi)，AHR或ALDH1A3的缺失在很大程度上消除了IDA促進(jìn)的腫瘤發(fā)展。有趣的是，厭氧菌在結(jié)直腸癌（CRC）患者中顯著富集。在異種移植模型和ApcMin/+小鼠中，IDA治療或厭氧消化鏈球菌的植入均可促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展?？傊?，作者的研究結(jié)果表明，靶向IDA-AHR-ALDH1A3軸應(yīng)該有望用于鐵衰相關(guān)的CRC治療。本文章于2024年1月發(fā)表在《nature cell biology》，IF：21.3。

機(jī)制圖：

主要研究結(jié)果：

1. IDA作為鐵死亡抑制因子的鑒定

第一部分，為了測試腸道微生物代謝物是否會影響癌細(xì)胞鐵死亡敏感性，作者在786-O人腎腺癌細(xì)胞中建立了包含350種內(nèi)源性人宿主和腸道微生物代謝物的篩選庫，用于檢測鐵死亡（圖1a）。篩選數(shù)據(jù)確定了腸道微生物群色氨酸代謝產(chǎn)生的IDA，它顯著抑制RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡（圖1b）。為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，利用兩種典型的對鐵死亡敏感的癌細(xì)胞系786-O和HT1080人纖維肉瘤細(xì)胞來測試IDA的作用，發(fā)現(xiàn)IDA處理的細(xì)胞對鐵死亡具有強(qiáng)大的抗性（圖1c，d）。作者還檢測了IDA培養(yǎng)HT1080細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平，發(fā)現(xiàn)IDA顯著降低了脂質(zhì)過氧化（圖1e），表明IDA是一種有效的鐵死亡抑制因子。

圖1 IDA是一種有效的鐵死亡抑制因子

腸道微生物群利用色氨酸合成多種衍生物，因此作者研究了其他腸道微生物來源的色氨酸代謝物是否可以調(diào)節(jié)鐵死亡。發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充10 μM的IDA可以有效地消除HT1080細(xì)胞中的鐵死亡，而低劑量（10 - 100 μM）的其他色氨酸衍生物則沒有表現(xiàn)出很強(qiáng)的保護(hù)作用（圖1f）。此外，補(bǔ)充IDA可以極大地消除HT29人結(jié)腸癌細(xì)胞中的鐵死亡（圖1g）。由于IDA在抑制鐵死亡方面更有效，因此作者將注意力集中在IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制上。在HT29細(xì)胞和MC38小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中，IDA處理顯著抑制了高水平的鐵死亡和脂質(zhì)過氧化（圖1h-k）。為了研究IDA是否作為自由基捕獲抗氧化劑（RTAs）來抑制鐵死亡，作者預(yù)測了所有色氨酸代謝物的親脂性，表明IDA不能直接減少氧化脂質(zhì)（圖1l），提示IDA可能通過細(xì)胞信號通路介導(dǎo)鐵死亡。

2. IDA促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展

圖2 IDA促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展

由于體外二維細(xì)胞培養(yǎng)缺乏許多癌癥的特征，如缺氧、細(xì)胞間接觸改變和重新連接代謝，作者將HT29和MC38細(xì)胞培養(yǎng)成三維（3D）腫瘤球體，以更好地模擬體內(nèi)環(huán)境。如圖2a、b和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2f所示，RSL3-或咪唑酮erastin （IKE）-誘導(dǎo)的HT29腫瘤球體鐵死亡在很大程度上被IDA或脂前列腺素-1 （Lipro-1）所抑制。同樣，在HT29類器官（圖2c、d）中也觀察到類似的結(jié)果。

為了確定IDA是否對腫瘤進(jìn)展具有保護(hù)作用，作者進(jìn)行了HT29異種移植，發(fā)現(xiàn)IDA顯著地消除了脂質(zhì)過氧化并促進(jìn)了腫瘤發(fā)展（圖2e-g）。與這一發(fā)現(xiàn)一致，IDA對C57BL/6J小鼠的鐵死亡具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，并促進(jìn)MC38異種移植物的進(jìn)展（圖2h-j）。這些結(jié)果表明體內(nèi)低濃度的IDA足以通過抑制鐵死亡來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

3. AHR是IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制所必需的

先前的研究表明吲哚代謝物是AHR的幼稚配體。為了確定AHR是否參與IDA調(diào)控的鐵死亡抑制，作者使用了AHR的拮抗劑BAY-218和StemRe genin 1 （SR1），發(fā)現(xiàn)AHR拮抗劑顯著地消除了IDA調(diào)節(jié)的鐵死亡抑制（圖3a）。接下來，作者沉默了HT29和HT1080細(xì)胞中的基因表達(dá)（圖3b）。IDA在表達(dá) （sh）-AHR的細(xì)胞中未能抑制鐵死亡（圖3c）。此外，作者通過 （CRISPR）-Cas9技術(shù)敲除AHR（圖3d）。由于缺乏AHR表達(dá)，IDA未能緩解鐵死亡（圖3e、f）。

此外，通過AHR的異位表達(dá)，IDA介導(dǎo)的AHR null HT29細(xì)胞中的鐵死亡抑制得以恢復(fù)（圖3g-j）。為了研究AHR是否有助于體內(nèi)IDA介導(dǎo)的腫瘤發(fā)展，作者進(jìn)行了野生型（WT）和AHR KO HT29異種移植實驗，并證實IDA在AHR?/?細(xì)胞中的保護(hù)作用基本被消除（圖3k-n）。

4. FSP1是IDA抗鐵死亡作用所必需的

FSP1利用NAD（P）H催化還原性輔酶Q10的產(chǎn)生，可保護(hù)細(xì)胞免于鐵死亡。因此，作者在HT29和HT1080細(xì)胞中生成了FSP1?/?克隆，以驗證FSP1是否有助于IDA調(diào)節(jié)的鐵死亡抗性。如圖4a，b所示，HT29細(xì)胞中FSP1的KO在很大程度上取消了IDA-AHR軸的保護(hù)作用，而WT HT29細(xì)胞對IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制有明顯反應(yīng)。同樣，HT1080細(xì)胞中FSP1的缺乏完全阻斷了IDA的抗鐵死亡作用，類似于HT29 FSP1 sgRNA細(xì)胞（圖4c-f）。相反，FSP1的異位表達(dá)挽救了這種表型（圖4g，h）。此外，在HT29 WT細(xì)胞中，IDA的補(bǔ)充促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展，而在FSP1 KO細(xì)胞中，IDA的作用在很大程度上被取消（圖4i，j），這表明IDA-AHR軸介導(dǎo)的鐵死亡抑制依賴于FSP1。

圖3 IDA介導(dǎo)的鐵死亡抑制需要AHR

5. IDA通過AHR-ALDH1A3-FSP1-CoQ10軸抑制鐵死亡

上述發(fā)現(xiàn)提出了FSP1如何參與IDA-AHR介導(dǎo)的鐵死亡抑制的問題。為了闡明這個問題，作者對IDA處理的HT29細(xì)胞進(jìn)行了RNA測序（RNA-seq）。在IDA可能介導(dǎo)的基因中，ALDH1A3是上調(diào)最多的（圖5a）。逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR （RT-qPCR）和western blotting分析證實，在IDA處理下，ALDH1A3的信使RNA和蛋白水平顯著升高（圖5b、c），這表明ALDH1A3可能是AHR的直接下游靶點。因此，作者接下來尋找ALDH1A3啟動子周圍潛在的AHR結(jié)合位點。通過與公認(rèn)的AHR結(jié)合基序（GCGTG）比較，作者發(fā)現(xiàn)了三個潛在的結(jié)合區(qū)（R1-R3），其中R3包含一個相同的序列（圖5d）。在接受或未接受IDA治療的HT29中進(jìn)行ChIP檢測。有趣的是，在IDA處理下，內(nèi)源性AHR在ALDH1A3轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游約100 bp處表現(xiàn)出與R3的強(qiáng)結(jié)合親和力 （圖5e），這表明在AHR被IDA激活的情況下，AHR在ALDH1A3啟動子上募集。

圖4 IDA的抗鐵死亡效應(yīng)需要FSP1

為了檢驗ALDH1A3在鐵死亡中的作用，作者阻斷了HT29細(xì)胞中ALDH1A3的表達(dá)，并檢測了鐵死亡細(xì)胞的死亡水平。如圖5f，g所示，ALDH1A3的缺失明顯使細(xì)胞對脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的鐵死亡敏感。此外，ALDH1A3表達(dá)降低會損害IDA抑制鐵死亡的能力（圖5h）。ALDH1A3特異性地利用全反式視黃醛作為底物產(chǎn)生NADH，視黃醛或維生素a調(diào)節(jié)的鐵死亡保護(hù)依賴于ALDH1A3（圖5i），表明視黃醛通過ALDH1A3的酶活性使細(xì)胞抵抗鐵死亡。作者還使用ALDH1酶抑制劑雙硫侖來測試ALDH1A3的作用，雙硫侖誘導(dǎo)高水平的鐵死亡細(xì)胞死亡，并減弱了IDA和ALDH1A3介導(dǎo)的鐵死亡抑制作用（圖5j）。

圖5 IDA通過AHR-ALDH1A3-FSP1-CoQ10軸抑制鐵死亡

為了研究ALDH1A3在腫瘤發(fā)展中的作用，作者測試了ALDH1A3的缺失或藥理抑制是否會影響腫瘤細(xì)胞的生長。結(jié)果顯示，ALDH1A3的缺失抑制了腫瘤的進(jìn)展，阻斷了IDA促進(jìn)的腫瘤生長（圖5k， l）。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)支持IDA-AHR通路介導(dǎo)的鐵死亡抑制依賴于ALDH1A3。

為了進(jìn)一步驗證ALDH1A3產(chǎn)生的NADH是否參與FSP1介導(dǎo)的還原性輔酶Q10合成，作者首先研究了ALDH1A3產(chǎn)生NADH的酶活性。體外實驗表明，純化的ALDH1A3可以通過視黃醛產(chǎn)生NADH（圖5m，n）。此外，ALDH1A3缺失顯著降低了NADH水平，而在ALDH1A3 KO細(xì)胞中補(bǔ)充NADH可恢復(fù)鐵死亡（圖5o，p）。此外，在ALDH1A3?/?和FSP1?/?細(xì)胞中檢測到較低比例的還原為氧化的CoQ10（圖5q）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明ALDH1A3對于IDA-AHR-FSP1-COQ10介導(dǎo)的鐵死亡抑制至關(guān)重要。

6. 厭氧消化鏈球菌是IDA生物合成的主要因素

為了研究IDA在結(jié)直腸癌發(fā)展中的來源，作者從健康人和結(jié)直腸癌患者的糞便中分離出微生物物種，并分別使用16S核糖體RNA基因測序和質(zhì)譜（MS）進(jìn)行代謝組學(xué)分析，對微生物群的位置進(jìn)行了大規(guī)模表征。發(fā)現(xiàn)厭氧消化鏈球菌在CRC患者中顯著富集（圖6a）。MS代謝物分析顯示，產(chǎn)生了可檢測的IDA含量（圖6b）。此外，CRC患者糞便中的IDA含量遠(yuǎn)高于健康人（圖6c），厭氧消化鏈球菌的豐度與糞便中的IDA水平呈正相關(guān)（圖6d）。

作者在厭氧條件下培養(yǎng)厭氧消化鏈球菌，并使用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測上清液中各種色氨酸衍生物的水平。事實上，厭氧菌有效地利用色氨酸產(chǎn)生高水平的IDA和IPA（圖6e，f）。作者觀察到12 h時IDA的濃度達(dá)到15 μM左右（圖6e）。此外，厭氧菌上清液處理后，HT29細(xì)胞中ALDH1A3和CYP1A2水平顯著升高，而大腸桿菌上清液對HT29細(xì)胞無影響（圖6g，h）。此外，在添加厭氧菌上清液的細(xì)胞中，鐵死亡明顯受到抑制（圖6i）。AHR的缺失使其失效，而AHR的過表達(dá)恢復(fù)了其保護(hù)作用（圖6j）。

先前的研究表明，厭氧消化鏈球菌特異性粘附在結(jié)直腸癌粘膜上，并且厭氧消化鏈球菌與結(jié)直腸癌細(xì)胞的直接相互作用使得產(chǎn)生足夠濃度的IDA來抑制結(jié)直腸癌鐵死亡成為可能。為了進(jìn)一步證明體內(nèi)IDA的生理濃度是否防御鐵死亡并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，作者首先在體內(nèi)進(jìn)行了厭氧卟啉單胞菌體內(nèi)注射，并檢測了腫瘤中IDA的含量。IDA在腫瘤中的濃度（約5μM）有效地降低了CRC鐵死亡并促進(jìn)了腫瘤生長（圖7a–d）。此外，IDA的生理濃度足以消除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡（圖7a-d）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，生理濃度的IDA在體外和體內(nèi)都能有效抑制鐵死亡。

圖6 厭氧菌是IDA生物合成的主要因子

7. 厭氧消化鏈球菌或IDA促進(jìn)原位結(jié)直腸癌進(jìn)展

為了更好地模擬體內(nèi)腸道微生物群驅(qū)動的腫瘤發(fā)生，作者采用Apc突變（ApcMin/+）驅(qū)動的CRC模型來進(jìn)一步研究。如圖7e所示，厭氧消化鏈球菌在結(jié)腸炎癥中表現(xiàn)出有效的定植（圖7f）。此外，厭氧消化鏈球菌處理的ApcMin/+小鼠具有更高的腫瘤多樣性（圖7g-j），表明厭氧消化鏈球菌加速了ApcMin/+小鼠的結(jié)直腸發(fā)育。

作者進(jìn)一步探討厭氧消化鏈球菌介導(dǎo)的CRC發(fā)展是否依賴于IDA。為此，無菌小鼠被厭氧菌灌胃，這是更好地研究腸道微生物特征的有力工具。72h后，將這些小鼠安樂死，以檢測血清色氨酸代謝物的豐度（圖7k）。與體外實驗結(jié)果一致，添加厭氧消化鏈球菌后，IDA和IPA顯著增加（圖7l，m），表明厭氧消化鏈球菌在體內(nèi)負(fù)責(zé)IDA的生物合成。接下來，作者評估補(bǔ)充IDA是否會驅(qū)動ApcMin/+小鼠的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生（圖7n），經(jīng)IDA處理的ApcMin/+小鼠顯示出明顯更高的腫瘤多樣性（圖7o）。進(jìn)一步建立偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（AOM/DSS）結(jié)腸炎相關(guān)癌癥模型，發(fā)現(xiàn)IDA和厭氧p顯著促進(jìn)結(jié)腸炎誘導(dǎo)的CRC進(jìn)展（圖7p，q）。

圖7 厭氧消化鏈球菌或IDA促進(jìn)原位CRC進(jìn)展

接下來，作者分析了AHR在臨床樣本中的功能后果，發(fā)現(xiàn)AHR和ALDH1A3在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)（圖8a-c）。此外，AHR的高表達(dá)與CRC患者臨床預(yù)后差呈正相關(guān)（圖8d）。免疫組織化學(xué)（IHC）和western blotting分析一致顯示，AHR和ALDH1A3在人類CRC樣本中表達(dá)更高（圖8e-h）。此外，4-羥基-2-壬烯醛（4-HNE）、3，4-亞甲基二氧安非他明（MDA）和8-羥基-2 ' -脫氧鳥苷（8-OHDG）的免疫組化染色顯示，結(jié)直腸癌中脂質(zhì)過氧化水平較低（圖8i-k）?？傊?，作者的研究表明IDA-AHR-ALDH1A3 FSP1通路通過抑制鐵死亡促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展。

圖8 AHR-ALDH1A3通路與CRC患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)

在本研究中，作者證明了IDA在CRC發(fā)展中的重要作用。具體來說，作者的工作表明，IDA作為AHR的內(nèi)源性配體，轉(zhuǎn)錄上調(diào)ALDH1A3的表達(dá)，ALDH1A3產(chǎn)生的NADH用于FSP1介導(dǎo)的還原輔酶Q10的合成。CRC細(xì)胞中AHR或ALDH1A3的缺乏極大地抑制了IDA促進(jìn)的腫瘤發(fā)展。作者的研究對于了解不同色氨酸代謝物在腫瘤進(jìn)展中的作用具有重要意義。

實驗方法：

細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建，細(xì)菌的分離、培養(yǎng)和鑒定，WB，細(xì)胞活力、細(xì)胞死亡及流式細(xì)胞術(shù)測定，DPPH檢測，FENIX檢測，3D腫瘤模型構(gòu)建，類器官構(gòu)建，質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染，定量PCR，ChIP檢測，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核分離，NADH水平檢測，CoQ和CoQH2分析，LC–MS分析。

參考文獻(xiàn)：

Cui W， Guo M， Liu D， Xiao P， Yang C， Huang H， Liang C， Yang Y， Fu X， Zhang Y， Liu J， Shi S， Cong J， Han Z， Xu Y， Du L， Yin C， Zhang Y， Sun J， Gu W， Chai R， Zhu S， Chu B. Gut microbial metabolite facilitates colorectal cancer development via ferroptosis inhibition. Nat Cell Biol. 2024 Jan；26(1)：124-137. doi： 10.1038/s41556-023-01314-6. Epub 2024 Jan 2. PMID： 38168770.