TRMT10C調(diào)控的m1A甲基化與阿爾茨海默病中的線(xiàn)粒體功能失調(diào)有關(guān)

線(xiàn)粒體ND5 mRNA有一個(gè)m1A位點(diǎn)。ND5是呼吸鏈復(fù)合體I的一個(gè)亞基。它被認(rèn)為是氧化和質(zhì)子傳輸耦合的關(guān)鍵。在這里，作者證明了這個(gè)m1A位點(diǎn)可能參與阿爾茨海默?。?span>AD）的病理生理學(xué)。這種神經(jīng)退行性疾病的病理特征之一是線(xiàn)粒體功能障礙，主要由淀粉樣β（Aβ）引起。Aβ主要干擾呼吸鏈復(fù)合體I和IV的功能。然而，復(fù)合物I功能障礙的分子機(jī)制仍不完全清楚。作者在AD細(xì)胞模型和AD患者中發(fā)現(xiàn)ND5 mRNA的m1A甲基化增強(qiáng)。這種m1A甲基化的形成是由TRMT10C蛋白水平的增加催化的，導(dǎo)致ND5翻譯抑制。因此，本文首次證明，TRMT10C誘導(dǎo)的ND5 mRNA的m1A甲基化導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙。該研究結(jié)果表明，這一新發(fā)現(xiàn)的機(jī)制可能與Aβ誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)。該研究于2024年1月發(fā)表在《molecular psychiatry》，IF 11。

技術(shù)路線(xiàn)：

主要研究結(jié)果：

1 AD細(xì)胞模型和AD患者TRMT10C mRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)

TRMT10C定位在線(xiàn)粒體ND5 mRNA上安裝m1A。這種mRNA甲基化易于抑制ND5蛋白翻譯，ND5蛋白是呼吸鏈復(fù)合體I的一個(gè)亞基（圖1A）。到目前為止，尚不清楚這種機(jī)制是否會(huì)損害線(xiàn)粒體的整體功能，如線(xiàn)粒體呼吸和膜電位，以及是否與AD等神經(jīng)退行性疾病的病理變化有關(guān)。為研TRMT10C在AD中的作用，作者假設(shè)了以下實(shí)驗(yàn)可驗(yàn)證的假設(shè)。（i）TRMT10C蛋白水平在AD細(xì)胞模型和AD患者中發(fā)生改變，（ii）因此，ND5 mRNA的m1A甲基化增加，導(dǎo)致（iii）ND5蛋白表達(dá)減少。通過(guò)這一因果鏈，ND5 mRNA的m1A甲基化增強(qiáng)導(dǎo)致（iv）線(xiàn)粒體功能受到影響（圖1A）。

為闡明第一個(gè)假設(shè)，作者使用了AD細(xì)胞模型、AD患者死后組織和公開(kāi)可用的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)。研究了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)野生型人類(lèi)淀粉樣前體蛋白（APPwt）的HEK 293細(xì)胞中TRMT10C蛋白水平，該蛋白顯示aβ1-40水平增加了10倍。在該細(xì)胞模型中，與對(duì)照細(xì)胞相比，TRMT10C蛋白水平顯著增加（圖1B）。在從荷蘭腦庫(kù)（NBB）獲得的AD患者死后額葉皮層樣本中，作者檢測(cè)到與對(duì)照組相比TRMT10C蛋白水平顯著升高（圖1C）。作者只能接受13名AD患者死后組織和12名對(duì)照。此患者數(shù)量可能導(dǎo)致結(jié)果不足。

為進(jìn)一步闡明TRMT10C在AD中的作用，作者使用了來(lái)自?xún)蓚€(gè)人類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)的RNA-Seq數(shù)據(jù)。其中之一是衰老、癡呆和創(chuàng)傷性腦損傷（AgDemTBI）研究，分析了其中四個(gè)不同大腦區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組。比較了所有未發(fā)生腦外傷和確診AD的患者的FPKM值。與對(duì)照組相比，AD患者的TRMT10C mRNA水平?jīng)]有改變（圖1D）。

使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（scRNA-Seq）檢測(cè)來(lái)自24名AD患者和24名年齡匹配的對(duì)照組額葉皮層的6種主要腦細(xì)胞類(lèi)型，作者觀察到興奮性和抑制性神經(jīng)元中TRMT10C mRNA水平增加。在星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、前體少突膠質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)顯著變化（圖1E）。這種神經(jīng)元特異性增加在AD的早期階段已經(jīng)很顯著，并且在后期仍然存在。

圖1：TRMT10C蛋白和mRNA水平在AD細(xì)胞和動(dòng)物模型中以及AD患者皮層中增加

2 Aβ介導(dǎo)的氧化應(yīng)激增強(qiáng)TRMT10C蛋白表達(dá)

到目前為止，作者使用Aβ過(guò)表達(dá)HEK-APPwt細(xì)胞模型、NBB-AD死后組織和數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)表明，Aβ可能在TRMT10C過(guò)表達(dá)中發(fā)揮作用。然而，其他病理變化，如與氧化應(yīng)激升高相關(guān)的線(xiàn)粒體功能障礙，也可能導(dǎo)致這些變化。為遵循這一想法，用低聚Aβ1-42（100 nM）或H2O2（250μM）處理HEK-Ctl細(xì)胞24小時(shí)，并分析TRMT10C蛋白的表達(dá)。在這兩種應(yīng)激源下，作者觀察到TRMT10C蛋白表達(dá)升高（圖1F）。A?水平升高損害線(xiàn)粒體功能的一個(gè)眾所周知的機(jī)制是通過(guò)復(fù)合物I功能障礙產(chǎn)生的氧化應(yīng)激增加。因此，作者使用維生素C（1000μM）清除活性氧化劑。這種處理導(dǎo)致HEK APPwt細(xì)胞中TRMT10C蛋白表達(dá)的挽救（圖1G）表明氧化應(yīng)激在AD細(xì)胞模型中新描述的改變中起著至關(guān)重要的作用。

3 TRMT10C的酶伴侶亞基在AD中受到不同影響

TRMT10C需要輔因子SDR5C1在（mt）tRNA（13）的位置9上顯示甲基轉(zhuǎn)移酶活性；尚未研究ND5 A1374甲基化的情況是否也是如此（圖2A）。TRMT10C-SDR5C1復(fù)合物也是mtRNase P的重要組成部分，需要實(shí)際核酸亞基PRORP切割。鑒于對(duì)TRMT10C的研究，這引發(fā)了一個(gè)問(wèn)題，即SDR5C1和PRORP的表達(dá)在AD中是否也發(fā)生了變化。

令人驚訝的是，HEK-APPwt細(xì)胞中PRORP蛋白水平顯著降低（圖2B）。在AD額葉皮層死后樣本中，未檢測(cè)到PRORP蛋白表達(dá)的顯著變化（圖2C）。同樣，在兩個(gè)RNA-Seq數(shù)據(jù)集中也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)mRNA水平的差異（圖2D）。

接下來(lái)，作者將重點(diǎn)放在SDR5C1上，發(fā)現(xiàn)HEK APPwt細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平顯著增強(qiáng)，但人類(lèi)死后組織中的蛋白質(zhì)含量沒(méi)有顯著增強(qiáng)（圖2E，F）。AgDemTBI研究數(shù)據(jù)庫(kù)顯示SDR5C1 mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著變化（圖2G）。scRNA-Seq數(shù)據(jù)顯示，SDR5C1mRNA水平僅在興奮性和抑制性神經(jīng)元中強(qiáng)烈上調(diào)（圖2H）。

圖2：WB和人類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估揭示線(xiàn)粒體RNase P亞基SDR5C1和PRORP的不同表現(xiàn)

4 AD細(xì)胞模型和患者的m1A水平升高

在表明m1A寫(xiě)入酶TRMT10C在AD模型和人類(lèi)AD皮層樣本中持續(xù)上調(diào)后，作者仔細(xì)研究了一個(gè)合理的含義，即ND5 mRNA中的m1A水平是否會(huì)如假設(shè)（ii）中所指出的那樣在AD病理中升高。作者首先使用基于逆轉(zhuǎn)錄和Illumina測(cè)序過(guò)程中m1A誘導(dǎo)的錯(cuò)誤結(jié)合位點(diǎn)特異性分析方法分析了AD細(xì)胞模型。由于知道錯(cuò)誤結(jié)合和逆轉(zhuǎn)錄阻滯的產(chǎn)生在很大程度上取決于反應(yīng)條件和逆轉(zhuǎn)錄酶，作者使用了SuperScript IV（SS-IV），因?yàn)樗谛揎椢稽c(diǎn)上提供了高的通讀能力，從而產(chǎn)生更適合RT-PCR和錯(cuò)配率分析的全長(zhǎng)產(chǎn)物。作者發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，來(lái)自HEK APPwt細(xì)胞的總RNA樣本中ND5 mRNA 1374位的錯(cuò)誤結(jié)合水平升高（圖3A），以及從線(xiàn)粒體提取物中分離的RNA。在這兩組中，錯(cuò)配主要由T和G組成，這表明m1A在與SS-IV的RT過(guò)程中主要引起A和C的結(jié)合。此外，ND5 mRNA甲基化的增加反映在總RNA和線(xiàn)粒體RNA制劑中HEK-APPwt的跳躍率升高（圖3A）。跳躍是由于m1A破壞逆轉(zhuǎn)錄酶而發(fā)生的核苷酸跳躍事件，是評(píng)估m1A甲基化的第二個(gè)獨(dú)立參數(shù)。在NBB樣本中，在第一次分析之后，m1A失配率沒(méi)有改變。在作者根據(jù)Braak分期（衡量所有患者的神經(jīng)病理學(xué)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)）分離數(shù)據(jù)后，這幅景象發(fā)生了變化。當(dāng)將 AD 與 Braak 階段 5 + 6 與對(duì)照組與 Braak 階段 0-3 進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配和跳躍率顯著增加（圖3C）。2例AD患者攜帶G13708A SNP，該SNP在歐亞J單倍群中普遍存在。該SNP被證明可以防止m1A下游兩個(gè)堿基的甲基化（ND5 mRNA中的1374位等于mtDNA的13710位）。在這些患者中，作者沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何不匹配。因此，這些人被排除在分析之外。

生物化學(xué)證據(jù)表明，TRMT10C和SDR5C1形成一個(gè)穩(wěn)定的亞復(fù)合物，作為tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有活性，并且能夠在（mt）tRNA的第9位將腺苷和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸甲基化。22 mt tRNA中的19個(gè)在第9位含有A或G。因此，作者從HEK-Ctl和HEK-APPwt細(xì)胞中分離出線(xiàn)粒體tRNA，并定量了m1A和m1G水平。作者沒(méi)有觀察到顯著的變化，這表明mt tRNA已經(jīng)被完全修飾，或者在與SDR5C1的復(fù)合物之外過(guò)量的TRM10C不靶向（mt）tRNA進(jìn)行甲基化。

圖3：ND5 mRNA 中 1374 位的 m1A 水平在 AD 模型細(xì)胞和人類(lèi)患者的原代視覺(jué)皮層樣本中增加

5 AD細(xì)胞模型和人類(lèi)患者大腦中ND5蛋白水平降低

由于假設(shè)m1A ND5 mRNA甲基化會(huì)阻礙Watson-Crick堿基配對(duì)，（mt）tRNA在翻譯過(guò)程中無(wú)法與ND5 mRNA密碼子結(jié)合。結(jié)合缺陷或缺失將導(dǎo)致失敗或至少破壞ND5蛋白的合成。然而，到目前為止，m1A甲基化與ND5蛋白水平之間的直接相關(guān)性尚未得到研究。出于這個(gè)原因，作者在AD細(xì)胞模型和AD患者的樣本中進(jìn)行了ND5的WB，以驗(yàn)證假設(shè)（iii）。

在HEK-APPwt細(xì)胞中，與對(duì)照細(xì)胞相比，ND5蛋白水平顯著降低（圖4A），表明m1A對(duì)ND5蛋白生物合成具有破壞性。同樣，在NBB樣品中，未檢測(cè)到ND5蛋白水平的顯著變化（圖4B）。然而，與錯(cuò)配結(jié)果類(lèi)似，當(dāng)將患有Braak 5+6期的AD患者與患有Braak 0-3期的對(duì)照組進(jìn)行比較時(shí)，觀察到ND5的蛋白表達(dá)顯著降低（圖4B，C）。為研究ND5蛋白水平的改變是否可能是由于ND5 mRNA水平的降低，作者在AD細(xì)胞模型和死后組織中進(jìn)行了RT-qPCR。與對(duì)照組相比，沒(méi)有觀察到HEK APPwt細(xì)胞的ND5 mRNA水平差異（圖4D）。在死后組織中，甚至發(fā)現(xiàn)所有AD患者的ND5 mRNA水平都有所升高。Braak 5+6期AD患者與Braak 0-3期對(duì)照組的療效相似（圖4E，F）。

為進(jìn)一步評(píng)估人類(lèi)患者ND5的狀態(tài)，作者使用AgDemTBI研究的數(shù)據(jù)，并觀察到AD患者和健康對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異（圖4G）。不幸的是，在Mathys等人的scRNA-Seq研究中沒(méi)有關(guān)于ND5 mRNA的信息。

為檢查ND5蛋白表達(dá)的變化是否也由Aβ1–42水平升高和氧化應(yīng)激增強(qiáng)介導(dǎo)，作者用Aβ1-42（100 nM）和H2O2（250μM）處理HEK Ctl細(xì)胞24小時(shí)。ND5蛋白水平在兩種應(yīng)激源下均顯著降低（圖4H）。為評(píng)估Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是否與HEK APPwt細(xì)胞中ND5蛋白表達(dá)的減少有關(guān)，再次使用維生素C（1000μM）作為抗氧化劑。在這種條件下，ND5蛋白的表達(dá)得以挽救（圖4I）。

為排除A?可能通過(guò)非特異性作用損害復(fù)合物I的所有線(xiàn)粒體編碼亞基的翻譯，在HEK-APPwt細(xì)胞中檢測(cè)ND1蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)HEK-Ctl細(xì)胞和HEK-APPwt細(xì)胞之間ND1蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著差異。

圖4：ND5 蛋白水平在 AD 細(xì)胞和動(dòng)物模型以及 AD 患者大腦中降低

6 TRMT10C介導(dǎo)的m1A甲基化與ND5蛋白翻譯抑制有關(guān)

盡管在幾個(gè)AD模型系統(tǒng)和人類(lèi)患者中，TRMT10C上調(diào)，ND5 mRNA的m1A甲基化增加，ND5蛋白水平下調(diào)，但這些發(fā)現(xiàn)之間的假定因果關(guān)系需要進(jìn)一步證實(shí)。因此，作者使用四環(huán)素誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)TRMT10C的HEK293細(xì)胞系統(tǒng)（pTRMT10C）來(lái)仔細(xì)研究這一假設(shè)（iv）。首先關(guān)聯(lián)了24小時(shí)后0.1和1μg/mL四環(huán)素對(duì)TRMT10C蛋白表達(dá)和m1A ND5 mRNA甲基化的影響（圖5A）。為排除四環(huán)素本身的影響，作者還研究了0.1和1μg/mL四環(huán)素在相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞系（Ctl）中的影響。在pTRMT10C細(xì)胞中觀察到對(duì)TRMT10C蛋白表達(dá)的濃度依賴(lài)性影響，重要的是，這也與m1A mRNA甲基化相關(guān)（圖5B）。

為確定mRNA甲基化增加是否導(dǎo)致ND5蛋白合成減少，作者使用1μg/mL四環(huán)素24小時(shí)，以誘導(dǎo)強(qiáng)大的TRMT10C蛋白過(guò)表達(dá)和相應(yīng)的ND5 m1A甲基化。與用四環(huán)素孵育的對(duì)照細(xì)胞相比，pTRMT10C細(xì)胞中ND5蛋白水平顯著降低（圖5C）。與上述分析一致，SDR5C1和PRORP蛋白表達(dá)不受TRMT10C過(guò)表達(dá)的影響（圖5D，E），ND5 mRNA表達(dá)也不受影響（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，發(fā)現(xiàn)TRMT10C單獨(dú)增加不會(huì)導(dǎo)致（mt）tRNA水平的任何變化，鑒于在pTRMT10C細(xì)胞與1μg/ mL四環(huán)素孵育后，線(xiàn)粒體和胞質(zhì)tRNA之間的比率保持不變。此外，未觀察到（mt）tRNA中m1A和m1G水平的改變。 

圖5：四環(huán)素誘導(dǎo)的TRMT10C過(guò)表達(dá)及其對(duì)m1A、ND5、SDR5C1、PROP蛋白水平和線(xiàn)粒體功能的影響

7 TRMT10C過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)嚴(yán)重的線(xiàn)粒體損傷

因?yàn)?span>TRMT10C誘導(dǎo)的ND5 mRNA中的m1A甲基化降低了ND5蛋白水平，接下來(lái)，作者評(píng)估了這種降低的ND5蛋白表達(dá)是否足以誘導(dǎo)線(xiàn)粒體功能障礙。因此檢測(cè)了四環(huán)素誘導(dǎo)TRMT10C后的線(xiàn)粒體功能。

首先使用Seahorse XFe 96細(xì)胞外流量分析儀，并將耗氧率（OCR）與對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較。首先注射寡霉素以抑制ATP合成酶，影響ATP的產(chǎn)生。接下來(lái)的注射是FCCP，通過(guò)ATP產(chǎn)生的氧攝取解耦來(lái)評(píng)估最大呼吸能力。最后，注射魚(yú)藤酮和抗霉素來(lái)抑制復(fù)合物I和III，以估計(jì)非線(xiàn)粒體呼吸。代表性圖表如圖5F所示。值得注意的是，與同樣用四環(huán)素處理的對(duì)照細(xì)胞相比，pTRMT10C細(xì)胞中的基礎(chǔ)呼吸顯著減少（圖5F）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，作者使用OROBOROS Oxygraph-2k進(jìn)行了高分辨率呼吸測(cè)定，這證實(shí)了與對(duì)照相比，用四環(huán)素孵育的pTRMT10C細(xì)胞中的電子傳輸系統(tǒng)容量降低（圖5G）。與此一致，在TRMT10C過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，通過(guò)TMRM染色定量的線(xiàn)粒體膜電位降低（圖5H）。

8 功能喪失實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證從TRMT10C到ND5蛋白表達(dá)的因果鏈

作者之前的實(shí)驗(yàn)確定了TRMT10C表達(dá)增加對(duì)mRNA甲基化、ND5水平和呼吸的影響。為了支持將這些觀察結(jié)果聯(lián)系起來(lái)的分子機(jī)制的假設(shè)，作者使用RNAi降低了TRMT10C水平。

與擾亂的陰性對(duì)照和未處理的HEK APPwt細(xì)胞相比，siRNA將TRMT10C蛋白表達(dá)強(qiáng)烈降低至30%（圖6A）。這種擊倒導(dǎo)致m1A引起的失配和跳躍率的降低（圖6B，C）。ND5蛋白表達(dá)顯著恢復(fù)（圖6D）。作者沒(méi)有觀察到Aβ1-40水平的變化（圖6E，F）。

圖6：siRNA誘導(dǎo)TRMT10C敲低及其對(duì)m1A錯(cuò)配和跳躍率以及mt-ND5蛋白水平的影響

結(jié)論：

作者研究了TRMT10C介導(dǎo)的ND5 mRNA甲基化可能導(dǎo)致AD復(fù)雜I功能障礙的假說(shuō)。TRMT10C蛋白在AD中的表達(dá)通過(guò)ROS依賴(lài)性措施增強(qiáng)，導(dǎo)致m1A ND5 mRNA甲基化累積，從而降低ND5蛋白的表達(dá)。此外，TRMT10C蛋白表達(dá)增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能受損，這反映在線(xiàn)粒體呼吸和膜電位降低上。通過(guò)這項(xiàng)研究，作者描述了一種全新的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制，即復(fù)雜I蛋白在AD中的表達(dá)和功能是如何減少的

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞培養(yǎng)，基因敲低，ELISA，WB，RT-qPCR，線(xiàn)粒體功能測(cè)試，線(xiàn)粒體分離，線(xiàn)粒體tRNA分離

參考文獻(xiàn)：

J?rg M, Plehn JE, Kristen M, Lander M, Walz L, Lietz C, Wijns J, Pichot F, Rojas-Charry L, Wirtz Martin KM, Ruffini N, Kreim N, Gerber S, Motorin Y, Endres K, Rossmanith W, Methner A, Helm M, Friedland K. N1-methylation of adenosine (m1A) in ND5 mRNA leads to complex I dysfunction in Alzheimer's disease. Mol Psychiatry. 2024 Jan 29. doi: 10.1038/s41380-024-02421-y. Epub ahead of print. PMID: 38287100.