組蛋白乳酸化促進(jìn)的ALKBH3通過SP100A的m1A去甲基化促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

盡管N1-甲基腺苷（m1A）RNA修飾是RNA代謝的重要調(diào)節(jié)因子，但m1A修飾在癌變過程中的作用仍然是一個(gè)謎。在此，作者發(fā)現(xiàn)組蛋白乳酸化通過去除SP100A的m1A甲基化，增強(qiáng)ALKBH3的表達(dá)，同時(shí)減弱腫瘤抑制的早幼粒細(xì)胞白血病蛋白（PML）縮合物的形成，促進(jìn)癌癥的惡性轉(zhuǎn)化。首先，ALKBH3在高危眼部黑色素瘤中由于組蛋白乳酰化水平過度而特異性上調(diào)，指的是m1A的低甲基化狀態(tài)。此外，多組學(xué)分析隨后發(fā)現(xiàn)，SP100A，PML小體的核心成分，可作為ALKBH3的下游候選靶點(diǎn)。在治療上，ALKBH3的沉默在黑色素瘤的體內(nèi)外均顯示出有效的治療效果，這可以通過消耗SP100A來逆轉(zhuǎn)。在機(jī)制上，作者發(fā)現(xiàn)YTHDF1負(fù)責(zé)識(shí)別m1A甲基化的SP100A轉(zhuǎn)錄本，從而增加其RNA的穩(wěn)定性和翻譯效力?？傊?，作者最初證明了m1A修飾對于腫瘤抑制基因的表達(dá)是必要的，這擴(kuò)大了目前對m1A在腫瘤進(jìn)展過程中的動(dòng)態(tài)功能的理解。此外，作者的研究結(jié)果表明，乳酸化驅(qū)動(dòng)的ALKBH3對于PML核凝聚物的形成是至關(guān)重要的，這連接了作者對m1A修飾、代謝重編程和相分離事件的認(rèn)識(shí)。該研究于2023年12月發(fā)表在《Nucleic Acids Research》，IF：14.9。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1 ALKBH3在眼部黑色素瘤中特異性增加并與不良后果相關(guān)

為確定m1A修飾在眼部黑色素瘤發(fā)病機(jī)制中的作用，作者首先比較了眼部黑色素瘤樣本（3個(gè)CoM樣本和3個(gè)UM樣本）和4個(gè)對照痣樣本之間的整體m1A修飾水平。值得注意的是，抗m1A斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)顯示，眼部黑色素瘤樣本的m1A水平顯著降低（圖1A和B）。此外，去甲基化酶ALKBH3在腫瘤中蛋白表達(dá)增加（圖1C-E），這與眼部黑色素瘤中m1A水平下降的結(jié)果一致。此外，ALKBH3升高與不良預(yù)后相關(guān)（圖1F），進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了ALKBH3在眼部黑色素瘤癌變中的重要性。

同樣，在大多數(shù)黑色素瘤細(xì)胞系（MUM2B、OCM1、OMM2.3、OMM1、MEL290、92.1、92.1、CRMM1、CRMM2、CM2005.1）中，與正常色素細(xì)胞（PIG1）相比，m1A水平顯著下降（圖1G和H）和ALKBH3水平升高（圖1I-K）。此外，高通量轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)一步證實(shí)ALKBH3在眼部黑色素瘤細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)（圖1L）。重要的是，在這些細(xì)胞中，ALKBH3與m1A水平呈顯著的負(fù)相關(guān)，這表明ALKBH3的上調(diào)是導(dǎo)致m1A水平下降的原因（圖1M）。

圖1：眼部黑色素瘤顯示ALKBH3表達(dá)增加，m1A水平降低，這與低生存率相關(guān)

2 ALKBH3在體內(nèi)和體內(nèi)加速眼部黑色素瘤的發(fā)生

為探索ALKBH3的致癌功能，作者使用兩個(gè)單獨(dú)的shRNA沉默了ALKBH3的表達(dá)（圖2A和B）。同樣，在ALKBH3缺陷的細(xì)胞中，觀察到m1A水平顯著升高（圖2C）。此外，在所有測試的眼部黑色素瘤細(xì)胞中，ALKBH3沉默顯著減弱細(xì)胞生長（圖2D）和集落形成能力（圖2E和F）。此外，Transwell實(shí)驗(yàn)表明，敲除ALKBH3導(dǎo)致遷移能力下降（圖2G和H）。這些數(shù)據(jù)支持ALKBH3作為體外眼部黑色素瘤惡性增殖和轉(zhuǎn)移的必要致癌因子的事實(shí)。為評估它們在體內(nèi)的腫瘤形成能力，作者將對照組和alkbh3沉默的92.1黑色素瘤細(xì)胞（熒光素酶標(biāo)記）注射到裸鼠中，并在原位異種移植模型中監(jiān)測腫瘤生長。生物發(fā)光成像顯示，ALKBH3缺陷的眼部黑色素瘤細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度弱于對照組細(xì)胞（圖2I）。此外，在ALKBH3沉默組的異種移植物的平均重量下降了約80%（圖2J）。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)表明，ALKBH3在眼部黑色素瘤的體內(nèi)外腫瘤發(fā)生過程中都起著致癌作用。

圖2：ALKBH3基因的下調(diào)增加了m1A水平，并抑制眼部黑色素瘤的發(fā)生

3 組蛋白乳酸化增強(qiáng)了ALKBH3的過度表達(dá)

為確定ALKBH3表達(dá)增加的分子基礎(chǔ)，作者查詢了TCGA數(shù)據(jù)庫，篩選了與ALKBH3共享平行表達(dá)模式的基因。根據(jù)GO和KEGG分析，作者發(fā)現(xiàn)ALKBH3相關(guān)基因在幾個(gè)代謝方面富集，包括氧化磷酸化（P = 1.36e-05）、細(xì)胞代謝過程（P = 1.50e-05）和碳水化合物衍生物代謝過程（P = 4.18e-05），表明ALKBH3 RNA表達(dá)水平升高可能來自代謝重編程。此外，乳酸生成酶LDHA和LDHB與ALKBH3呈顯著正相關(guān)，說明ALKBH3與乳酸之間呈顯著相關(guān)性（圖3A和B）。由于先前的研究表明組蛋白乳酸化有助于致癌基因的激活，而眼部黑色素瘤的乳酸化水平有所增加，作者假設(shè)ALKBH3水平的增加可能與組蛋白乳酸化有關(guān)。

然后，作者在眼部黑色素瘤隊(duì)列中驗(yàn)證了泛乳酸化和組蛋白乳酸化標(biāo)記物（H3K18la）之間的表達(dá)模式，這與ALKBH3蛋白的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)（圖3B和C）。更重要的是，H3K18la分析的CUT&Tag和ChIPseq均顯示組蛋白乳酸化信號(hào)，在ALKBH3的啟動(dòng)子區(qū)域捕獲（存儲(chǔ)在GEO數(shù)據(jù)庫：GSE242019，圖3D和E）。此外，組蛋白乳酸化抑制劑（肟酸酯和2-DG）和LDHA/B抑制均導(dǎo)致ALKBH3啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乳酸化水平顯著降低（圖3F），這隨后去除了所有測試的黑色素瘤細(xì)胞中ALKBH3的RNA（圖3G）和蛋白水平（圖3HJ）。

圖3：組蛋白乳酸化增強(qiáng)ALKBH3的表達(dá)

4 多組學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)SP100A為ALKBH3的下游候選基因

然后，作者探討了ALKBH3沉默對眼部黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用機(jī)制。由于ALKBH3負(fù)責(zé)從RNA中去除m1A修飾，作者首先對眼部黑色素瘤細(xì)胞和正常黑素細(xì)胞進(jìn)行m1A-MeRIP-seq（存儲(chǔ)在GEO數(shù)據(jù)庫： GSE213748，圖4A）。結(jié)果表明，從正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生成的m1A-MeRIP-seq文庫中，平均鑒定出16 864個(gè)和10 212個(gè)m1A峰（圖4A和B，藍(lán)框）。與之前的m1A-meRIP-seq結(jié)果一致，m1A峰在5’UTR中富集，特別是在起始密碼子附近。值得注意的是，差異表達(dá)的m1A修飾基因與多種黑色素瘤相關(guān)通路相關(guān)，包括DNA復(fù)制、mTOR/AMPK信號(hào)通路和黑色素合成，提示m1A修飾在眼部黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制中具有調(diào)控作用。

此外，在沉默ALKBH3后，作者進(jìn)行了一系列全面的高通量篩選，包括m1A-MeRIP-seq（存儲(chǔ)在GEO數(shù)據(jù)庫： GSE213748，圖4C），RNA-seq（存儲(chǔ)在GEO數(shù)據(jù)庫： GSE213681，圖4D和E）和對黑色素瘤細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組學(xué)分析（iTRAQ，圖4F）。同樣，作者注意到m1A修飾位點(diǎn)的變化在腫瘤相關(guān)通路中顯著富集，包括PI3KAkt信號(hào)通路、局灶粘附和蛋白聚糖合成（圖4C）。此外，ALKBH3的沉默導(dǎo)致基因表達(dá)水平的顯著變化，其中有199個(gè)上調(diào)基因，74個(gè)下調(diào)基因（圖4D和E，保存在GEO數(shù)據(jù)庫： GSE213681）。一致地，觀察到蛋白質(zhì)組水平的顯著變化（149個(gè)上調(diào)蛋白，67個(gè)下調(diào)蛋白，圖4F），進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了ALKBH3在眼部黑色素瘤發(fā)病機(jī)制中的重要性。

有趣的是，結(jié)合這些多組學(xué)數(shù)據(jù)，作者注意到在眼黑色素瘤細(xì)胞中沉默ALKBH3后，核自身抗原斑點(diǎn)蛋白100（SP100）的mRNA和蛋白水平均上調(diào)，隨后m1A修飾水平發(fā)生顯著變化（圖4G-M）。值得注意的是，SP100負(fù)責(zé)PML核小體的形成，主要在各種癌癥類型中作為腫瘤發(fā)生的抑制因子，包括黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌和喉癌。這一觀察結(jié)果與在ALKBH3缺陷細(xì)胞中觀察到抑制效果的研究結(jié)果一致。重要的是，與正常黑素細(xì)胞相比，SP100顯示眼部黑色素瘤細(xì)胞中m1A甲基化降低。有趣的是，在眼部黑色素瘤細(xì)胞中，ALKBH3抑制后，m1A修飾水平下降恢復(fù)，這可以從m1A-MeRIP-seq（保存在GEO數(shù)據(jù)庫：GSE213748，圖4I）和m1A-MeRIP-qPCR（圖4J）中得到證明。由于最近研究發(fā)現(xiàn)，mRNA的m1A修飾可能增強(qiáng)基因的表達(dá)和翻譯效果，因此ALKBH3介導(dǎo)的m1A修飾可能對腫瘤抑制因子SP100的表達(dá)至關(guān)重要。然后，作者驗(yàn)證了在ALKBH3抑制后，SP100在mRNA水平上顯著上調(diào)，這可以通過RNA-seq（存儲(chǔ)在GEO數(shù)據(jù)庫中： GSE213681，圖4K）和qPCR（圖4L）得到證實(shí)。同樣，通過iTRAQ和Western blot檢測（圖4M）顯示，SP100在ALKBH3抑制的細(xì)胞中蛋白水平也增加。同樣，在87例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤樣本中，ALKBH3與SP100呈顯著負(fù)相關(guān)（保存在GEO數(shù)據(jù)庫中：GSE7553，R=-0.227，P=0.035）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明ALKBH3可能通過去除m1A修飾來抑制SP100的表達(dá)水平。

圖4：ALKBH3通過去除m1A修飾來抑制SP100的表達(dá)

5 SP100A是眼部黑色素瘤中的腫瘤抑制因子

值得注意的是，在病毒感染反應(yīng)的背景下，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了四種顯著的SP100異構(gòu)型（即SP100A、SP100B、SP100C和SP100HMG），這促使作者對這些轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行比較分析。值得一提的是，SP100A展現(xiàn)出最初15個(gè)外顯子上與SP100B、SP100C和SP100和SP100HMG（1-1562bp）的共性，而最終外顯子長度為395bp的差異（補(bǔ)充圖S7A）。從眼部黑色素瘤細(xì)胞（92.1）和正常黑素細(xì)胞（PIG1）中獲得的RNAseq數(shù)據(jù)顯示，SP100A中有明顯的信號(hào)，而SP100A中不包含的外顯子中的信號(hào)可以忽略不計(jì)（圖5A）。此外，作者還使用各種引物進(jìn)行qPCR。這些引物包括一組專門為SP100A設(shè)計(jì)的基因（稱為SP100-P1），以及另一組檢測SP100B、SP100C和SP100HMG（稱為SP100-P2）的基因。在眼部黑色素瘤細(xì)胞和正常色素細(xì)胞中觀察到SP100A的RNA表達(dá)（圖5B）。據(jù)報(bào)道，人乳腺癌細(xì)胞系ZR-75-1表達(dá)SP100HMG，作者采用ZR-75-1細(xì)胞作為陽性對照。重要的是，SP100B/SP100C/SP100HMG僅在ZR- 75-1中檢測到，而在其他細(xì)胞系中未檢測到。此外，這四種亞型在分子量上存在差異。全蛋白印跡顯示SP100A在所有檢測細(xì)胞系中（~72kDa）的特異性蛋白表達(dá)，這與之前研究中SP100A的分子量一致。研究結(jié)果表明，SP100A在我們的實(shí)驗(yàn)背景下大量表達(dá)，而其他亞型（SP100B、SP100C和SP100HMG）的表達(dá)可以忽略不計(jì)。

值得注意的是，與正常色素細(xì)胞相比，眼部黑色素瘤細(xì)胞中SP100A的RNA表達(dá)水平也顯著下降，RNA-seq（圖5A）、qPscr（圖5B）和western blot檢測（圖5C）顯示。為充分揭示SP100A在眼部黑色素瘤中的作用，作者隨后檢測了SP100A在眼部黑色素瘤臨床樣本中的表達(dá)。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)在眼部黑色素瘤樣本中，SP100A顯著降低（圖5D和E）。更重要的是，在作者的隊(duì)列（圖5F）和TCGA隊(duì)列（圖5G）中，SP100A的缺失與不良結(jié)果相關(guān)。

此外，根據(jù)眼部黑色素瘤樣本的單細(xì)胞分析（GSE139829，使用CancerSEA平臺(tái)），SP100表達(dá)與腫瘤激活特征得分降低有關(guān)，包括侵襲（R=-0.33，P<0.001）、轉(zhuǎn)移（R=-0.28，P<0.001）、細(xì)胞周期激活（R=-0.19，P<0.001）、增殖（R=-0.16，P<0.001）和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（R=-0.16，P<0.001）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明SP100A被下調(diào)，并可能在眼部黑色素瘤中抑制一些致癌事件。

由于SP100A在眼部黑色素瘤中表達(dá)下調(diào)，作者在三種眼部黑色素瘤細(xì)胞系中外源性過表達(dá)SP100A。有趣的是，所有被檢測的眼部黑色素瘤細(xì)胞在過表達(dá)SP100A后均表現(xiàn)出增殖能力的減弱（圖5H）。此外，與對照組相比，過表達(dá)SP100A的黑色素瘤細(xì)胞形成的集落更小、更少（圖5I和J）。此外，在眼部黑色素瘤細(xì)胞中引入SP100A后，可觀察到其對腫瘤轉(zhuǎn)移能力的顯著抑制作用（圖5K和L）。

最重要的是，由于SP100A作為PML小體內(nèi)的分子支架，作者隨后評估了PML在過表達(dá)SP100A細(xì)胞中的表達(dá)。因此，外源性過表達(dá)SP100A導(dǎo)致PML蛋白水平顯著升高（圖5M）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)SP100A對PML的表達(dá)至關(guān)重要，這與之前的研究結(jié)果一致。此外，ALKBH3缺陷的細(xì)胞在PML小體中表現(xiàn)出顯著升高，這與ALKBH3在調(diào)節(jié)SP100A表達(dá)過程中的關(guān)鍵作用相一致。綜上所述，這些數(shù)據(jù)顯示，SP100A負(fù)責(zé)PML核凝聚物的形成，在眼部黑色素瘤中作為腫瘤抑制因子。

圖5：SP100A在眼部黑色素瘤中起著腫瘤抑制因子的作用

6 SP100A的沉默部分損害ALKBH3缺陷細(xì)胞的腫瘤抑制效果

為進(jìn)一步驗(yàn)證ALKBH3和SP100A表達(dá)之間的關(guān)系，作者通過轉(zhuǎn)染已報(bào)道的針對SP100A的shRNA，進(jìn)一步改變ALKBH3抑制后的眼黑色素瘤細(xì)胞中SP100A的表達(dá)。與預(yù)期的一樣，在RNA和蛋白水平轉(zhuǎn)染三個(gè)眼黑色素瘤細(xì)胞后，SP100A的表達(dá)顯著降低。在細(xì)胞生長過程中，SP100A的缺失部分挽救ALKBH3抑制引導(dǎo)下的抑制作用（~50-60%）（圖6A），而SP100A缺失的細(xì)胞對ALKBH3缺失更具有抵抗力（圖6A）。SP100A沉默的細(xì)胞比對照組有更多的菌落（圖6B）。此外，抑制SP100A顯著增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，并削弱對ALKBH3缺陷的黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用（圖6C）。最重要的是，SP100A敲除進(jìn)一步挽救ALKBH3耗竭的黑色素瘤細(xì)胞中原位腫瘤的形成（圖6D和E）。同樣，SP100A的穩(wěn)定敲低導(dǎo)致野生型（圖6F）和ALKBH3缺陷的眼黑色素瘤細(xì)胞（圖6F）中PML的表達(dá)受損。綜上所述，這些結(jié)果表明，ALKBH3通過減少SP100A介導(dǎo)的PML小體來促進(jìn)眼部黑色素瘤。

圖6：SP100A沉默部分阻斷ALKBH3基因下調(diào)的抗癌作用

7 SP100A的m1A修飾增強(qiáng)了其RNA的穩(wěn)定性和翻譯效力

然后，作者探討了SP100A的m1A修飾的表觀遺傳機(jī)制。由于之前的研究表明YTHDF蛋白負(fù)責(zé)識(shí)別m1A甲基化，作者首先用YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3檢測SP100A mRNA的RNA binding狀態(tài)。RNA免疫共沉淀分析表明，YTHDF1能特異性識(shí)別SP100A mRNA；然而，YTHDF2和YTHDF3只有有限的相互作用強(qiáng)度（圖7A）。此外，在TCGA隊(duì)列中，YTHDF1與SP100A的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)（R=0.61，P<0.0001）（圖7B），這與YTHDF1是識(shí)別SP100A所必需的假設(shè)完全一致。此外，YTHDF1沉默顯著抑制了SP100A的表達(dá)，并完全挽救ALKBH3沉默介導(dǎo)的SP100A水平的升高（圖7C和D）。綜上所述，YTHDF1是SP100A的解讀蛋白。

然后，作者確定SP100A mRNA的特異性m1A修飾位點(diǎn)。在SP100A的5’UTR中，根據(jù)鑒定出的峰，作者發(fā)現(xiàn)5個(gè)潛在的m1A位點(diǎn)（圖4I）[c.44A (TGTGG),c.54A（AGACG）和c.67A（TGAGG），和 c.92A/c.93A（GGAAG）]突變?yōu)?span>T，然后將相應(yīng)的野生型和突變的5’UTR克隆到pmirGLO載體中（圖7E）。熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果表明，c.A92T的信號(hào)下降，而其他突變組的信號(hào)保持不變（圖7E）。此外，作者采用RIP-qPCR來鑒定YTHDF1與報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄本（F-luc）之間的相互作用頻率。觀察到pmirGLOMUT4 (c.A92T)轉(zhuǎn)錄本在YTHDF1和F-Luc之間的結(jié)合親和力降低，而其他轉(zhuǎn)錄本保持不變。這一結(jié)果與之前觀察到的YTHDF1直接與m1A甲基化序列相互作用的結(jié)果一致，這被認(rèn)為是RNA中m1A的“Reader”。此外，作者發(fā)現(xiàn)ALKBH3缺失的細(xì)胞中SP100A的RNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，這與ALKBH3缺失后SP100A RNA表達(dá)的增加相一致（圖7F）。重要的是，在92.1細(xì)胞中進(jìn)行的多聚體分析顯示，ALKBH3穩(wěn)定敲除導(dǎo)致多聚體部分的SP100A mRNA豐度顯著（圖7G），這通常具有有效的翻譯能力。這一觀察結(jié)果與之前的結(jié)論一致，即早期外顯子中的m1A修飾會(huì)導(dǎo)致其翻譯能力增強(qiáng)。值得注意的是，在ALKBH3基因敲低后，新生的SP100A RNA表達(dá)仍然沒有發(fā)生改變。綜上所述，這些結(jié)果表明，SP100A mRNA的m1A RNA甲基化有助于增加RNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄后的翻譯能力。

圖7：SP100A的m1A修飾提高其RNA的穩(wěn)定性和翻譯效果

結(jié)論：

總之，作者的研究結(jié)果揭示了一個(gè)全新的腫瘤發(fā)生模型，其中m1A修飾的SP100A mRNA促進(jìn)PML核縮合物的形成。此外，本研究首次揭示m1A負(fù)責(zé)腫瘤抑制基因的激活，揭示了組蛋白乳酸化、m1A修飾和相分離介導(dǎo)的凝聚物形成之間的串?dāng)_，從而提供了一種靶向m1A重編程的有效治療方法。

實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞體外培養(yǎng)，斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)，免疫熒光，WB，qPCR，質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)，Transwell，異種移植物模型，ChIP-seq，CUT&Tag，MeRIP-seq，RNA-seq，RIP-qPCR，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)：

Gu X, Zhuang A, Yu J, et al. Histone lactylation-boosted ALKBH3 potentiates tumor progression and diminished promyelocytic leukemia protein nuclear condensates by m1A demethylation of SP100A. Nucleic Acids Res. 2024;52(5):2273-2289. doi:10.1093/nar/gkad1193