單細(xì)胞RNA測(cè)序解析子宮肌腺病的病理機(jī)制

本研究旨在利用scRNA-seq評(píng)估子宮腺肌癥的細(xì)胞和分子狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)子宮腺肌癥組織中的成纖維細(xì)胞具有高度異質(zhì)性。在子宮腺肌癥成纖維細(xì)胞中，WNT 信號(hào)涉及作為 WNTs 誘餌受體的分泌型相關(guān)蛋白的不同表達(dá)，這可能在該疾病的病理生理學(xué)中起著關(guān)鍵作用。本文于2023年5月發(fā)表在《Fertility and Sterility》IF:6.7雜志上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、子宮內(nèi)膜：一個(gè)包含成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞群的豐富復(fù)雜細(xì)胞景觀

從患有子宮肌腺病需行子宮切除術(shù)的子宮中收集子宮肌腺癥病理組織（AD）和臨近的正常子宮內(nèi)膜組織（EE），以及正常的子宮肌層組織（NM）（圖1A）。scRNA測(cè)序在EE共鑒定到21個(gè)細(xì)胞簇注釋為12種細(xì)胞類型：纖毛上皮細(xì)胞和纖毛上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、活化成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和潛在祖細(xì)胞（圖1B）。每種細(xì)胞類型的前幾個(gè)標(biāo)記物的表達(dá)見圖1C。無(wú)纖毛上皮細(xì)胞分為三組（E2、E17、E19），占子宮內(nèi)膜的11%。上皮細(xì)胞的典型標(biāo)記包括EPCAM、PAEP、MMP7和KRT18。還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)纖毛上皮細(xì)胞集群，它表達(dá)纖毛相關(guān)基因（C14），如RSPH1、AGR3 和PIFO；最近一項(xiàng)對(duì)正常子宮內(nèi)膜進(jìn)行 scRNA-seq 的研究描述了這種細(xì)胞類型（圖 1B-D）。免疫細(xì)胞占子宮內(nèi)膜的 24%。主要的免疫細(xì)胞是表達(dá)NKG7和GNLY 的NK細(xì)胞（7%）和表達(dá)CD3D和CD69 的 T 細(xì)胞（12%）（圖 1B-D）。成纖維樣細(xì)胞占子宮內(nèi)膜的絕大部分（36%），它們表達(dá)膠原和基質(zhì)相關(guān)基因（圖 1B-D）。在比較 3 位患者的子宮內(nèi)膜組織時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有 3 種組織都含有大多數(shù)細(xì)胞群，但含量各不相同（圖 1E）。成纖維細(xì)胞群 E0 和 E1 具有相似的基因表達(dá)譜，都表達(dá)SFRP4、COL1A1、LUM、MMP11、SFRP1、ECM1 和IGF1（圖 1F）。特征圖還顯示，這兩個(gè)群還表達(dá)子宮內(nèi)膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞表達(dá)的MME、ESR1 和PGR（圖 1G）。

一個(gè)與成纖維細(xì)胞密切相關(guān)的獨(dú)特細(xì)胞群（E7）顯示了周細(xì)胞標(biāo)志物COX4I2、MCAM、NOTCH3 和PDGFRB 的獨(dú)特表達(dá)。與E7相連的是表達(dá)MYL9、TINAGL、BCAM、MYH11、MYLK和ACTA2等標(biāo)記的血管平滑肌細(xì)胞群（E6）（圖1F）。由于在周細(xì)胞中持續(xù)檢測(cè)到干/祖細(xì)胞類型，所以作者從E7群開始進(jìn)行了擬時(shí)序分析（圖1F）。耐人尋味的是，從周細(xì)胞開始的分化軌跡經(jīng)過E0和E1的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，然后經(jīng)過活躍分化的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（E13），最后到達(dá)纖毛上皮（E14；圖1H）。因此，結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞可能起源于具有間充質(zhì)干細(xì)胞特征的周細(xì)胞。

數(shù)據(jù)還表明纖毛上皮細(xì)胞可能通過間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）從周細(xì)胞衍生而來(lái)。對(duì)這一MET軌跡的PROGENy分析表明，在分化的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（E13）和纖毛上皮細(xì)胞群（E14）中，PI3K和P53這兩種不同的信號(hào)通路分別上調(diào)（圖1I）。

圖1 子宮內(nèi)膜單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2、子宮肌腺癥以纖維化和高度異質(zhì)性的成纖維細(xì)胞群為主

scRNA測(cè)序在AD共鑒定到24個(gè)細(xì)胞簇注釋為13種細(xì)胞類型（圖2A）。與EE比較，AD組織具有更高的成纖維細(xì)胞組分（50%）和更低的上皮細(xì)胞組分（圖2B）。圖 2C和2D顯示了每位患者每個(gè)細(xì)胞亞群的相對(duì)比例以及每種細(xì)胞類型的基因標(biāo)記物。成纖維細(xì)胞樣群 A0、A6、A5、A1 和 A12 顯示出轉(zhuǎn)錄組的相似性，并代表了一個(gè)不同于 A2 和 A4 的群體，前者獨(dú)特地富集了平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物，而后者則具有細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的強(qiáng)烈特征（圖 2E）。在 A0 中，PROGENy 顯示 MAPK 和表皮生長(zhǎng)因子受體通路的激活，這兩種通路都與細(xì)胞增殖有關(guān)（圖 2H）。相鄰的 A6 簇高表達(dá)PDGFRA、COL6A3、MME、ESR1、RORB和HAND2，它們是間充質(zhì)祖細(xì)胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)記（圖 2E）。A6 中表達(dá)了PDGFRA和ESR1基因，表明間質(zhì)細(xì)胞在雌激素的驅(qū)動(dòng)下增殖和分化活躍。有趣的是，A6 的ESR1表達(dá)量最高，表明其對(duì)雌激素具有高度敏感性，而 A12 和 A5 的PGR表達(dá)量最高（圖 2F）。這種ESR1/PGR表達(dá)的進(jìn)展模式與擬時(shí)序分析顯示的分化方向一致，即 A0→A6→A12→A5（圖 2F、2G）。

圖2 子宮腺肌病組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

3、子宮肌層：成纖維細(xì)胞集群形成了一個(gè)有別于平滑肌細(xì)胞集群的群體

在子宮肌層中鑒定到20個(gè)亞群包含10種細(xì)胞類型。與EE和AD一樣，子宮肌層中的主要細(xì)胞類型是成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞團(tuán)（40%），其次是 SMC（18%）。

4、子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜和子宮肌層中成纖維細(xì)胞群的比較分析

接下來(lái)，作者評(píng)估了區(qū)分子宮腺肌病與子宮內(nèi)膜和子宮肌層的成纖維細(xì)胞群的不同基因表達(dá)模式（圖 3A、3B）。在子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜的成纖維細(xì)胞樣群中，最引人注目的觀察結(jié)果是 A0 與 E0 和 E1 子宮內(nèi)膜成纖維細(xì)胞非常相似（圖 3A）。這表明 A0 成纖維細(xì)胞代表了一個(gè)從子宮內(nèi)膜遷移到子宮肌層組織并導(dǎo)致子宮腺肌癥的群體（圖 1，圖 2A）。擬時(shí)序分析表明，A0、E0 和 E1 都具有類似祖細(xì)胞的特征，分化程度較高的成纖維細(xì)胞就來(lái)源于這些祖細(xì)胞（圖 1，圖 2G）。

當(dāng)對(duì)AD和子宮肌層成纖維細(xì)胞群進(jìn)行比較時(shí)（圖 3B），A4 與 M0 和 M11 顯示出驚人的相似性，它們都表達(dá)了最高水平的 MGP，似乎代表了每個(gè)組織中成纖維細(xì)胞樣群的終末分化群體（圖 2G）。MGP 是細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分，這種發(fā)現(xiàn)與所觀察到的腺肌瘤組織中細(xì)胞外基質(zhì)的增加相吻合。

耐人尋味的是，作為 WNT 通路調(diào)節(jié)劑的 SFRP 基因家族在成纖維細(xì)胞樣集群中表達(dá)突出，顯示出子宮內(nèi)膜、子宮腺肌病和子宮肌層之間的跨組織相似性（圖 3A、3B）。因此，作者首先測(cè)定了該基因家族成員在這三種組織中的差異表達(dá)（圖 3C）。腺肌病中SFRP1和SFRP4的水平均高于子宮內(nèi)膜或子宮肌層（圖3C）。基因SFRP2僅在子宮腺肌病和子宮肌層中表達(dá)（A4，M11；圖 3A-C）。據(jù)報(bào)道，SFRP2 是一種 WNT 拮抗劑，能下調(diào)雌激素依賴的 β-catenin 活性，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)肌生成。子宮內(nèi)膜中缺乏SFRP2的表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。因此，SFRP2可能是預(yù)測(cè)子宮腺肌病上皮細(xì)胞生長(zhǎng)潛力的關(guān)鍵標(biāo)志物。有趣的是，SFRP1和SFRP4在子宮腺肌病的所有成纖維細(xì)胞樣團(tuán)中都有表達(dá)，而SFRP2僅在 A4 中表達(dá)（圖 3D）。

圖3 3種組織類型成纖維細(xì)胞群體差異基因表達(dá)的比較分析

5、子宮內(nèi)膜和子宮腺肌病中的纖毛和無(wú)纖毛上皮細(xì)胞群分析

上皮是子宮腺肌癥的主要細(xì)胞類型，而子宮腺肌癥被認(rèn)為起源于子宮內(nèi)膜。因此，作者進(jìn)一步分析了匹配的AD組織和EE上皮細(xì)胞中的差異表達(dá)基因。首先，使用散點(diǎn)圖分析來(lái)確定組織中的纖毛上皮細(xì)胞和無(wú)纖毛上皮細(xì)胞（圖 4A）。不出所料，PAEP和MMP7 等經(jīng)典標(biāo)志物在無(wú)纖毛上皮細(xì)胞中的表達(dá)量明顯較高，而更多的基因在纖毛上皮細(xì)胞中顯著表達(dá)（圖 4A）。然后，分別鑒定了子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜中無(wú)纖毛上皮細(xì)胞和纖毛上皮細(xì)胞的差異表達(dá)基因（圖 4B、4C）。一般來(lái)說(shuō)，腺肌癥組織和子宮內(nèi)膜中的無(wú)纖毛上皮和纖毛上皮表現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)錄組特征。然而，在子宮內(nèi)膜的無(wú)纖毛上皮中，一些基因的表達(dá)明顯高于子宮內(nèi)膜，包括分化標(biāo)記物，如PAEP、PLCG2、HSPA1A 和HSP90AA1（圖 4B）。PAEP 標(biāo)志物又稱糖度蛋白，是一種分泌性糖蛋白，受孕酮調(diào)控，與分化和健康植入有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)可能表明，子宮腺肌癥無(wú)纖毛上皮細(xì)胞中存在孕酮抗性。在無(wú)纖毛和纖毛上皮細(xì)胞中，腺肌病患者熱休克蛋白（HSPA1A、HSP90AA1）的表達(dá)明顯低于子宮內(nèi)膜（圖 4B、4C）。由于某些熱休克蛋白對(duì)雌激素的作用很重要，而雌激素在子宮腺肌病中似乎也有作用，因此這一發(fā)現(xiàn)需要進(jìn)一步研究。

與子宮內(nèi)膜相比，子宮腺肌病無(wú)纖毛上皮細(xì)胞中與免疫功能相關(guān)的基因和通路上調(diào)（圖 4B、4D）。與免疫反應(yīng)和巨噬細(xì)胞活化相關(guān)的基因，如HLA-DRA、HLA-DRB1、CD74、NFKBIA 和S100A6，在子宮腺肌癥上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高（圖 4B）。這些基因也與細(xì)胞增殖、炎癥和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)。在腺肌病的上調(diào)途徑中，免疫反應(yīng)相關(guān)過程在腺肌病的纖毛上皮和無(wú)纖毛上皮中明顯上調(diào)（圖 4D）。此外，參與典型 WNT 信號(hào)通路和上皮細(xì)胞遷移調(diào)控通路的基因僅在腺肌病無(wú)纖毛上皮中上調(diào)。

在本研究中，WNT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成為基質(zhì)、上皮和 SMC 中受到不同調(diào)控的一個(gè)重要生物過程；因此，進(jìn)一步分析腺肌癥組織中所有細(xì)胞類型之間的旁分泌和內(nèi)分泌 WNT 相關(guān)相互作用（圖4E）。WNT信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)了多種信號(hào)，分別來(lái)自成纖維細(xì)胞群 A0、A1、A5 和 A12，以及上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞群 A10、A13、A14 和 A18（圖 4E）。配體（WNT）及其受體（FZD和LRP）在各細(xì)胞簇中的表達(dá)分布支持了基質(zhì)細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞發(fā)出信號(hào)的方向性（圖 4F）。特別是，WNT2和WNT4在腺肌病特異性成纖維細(xì)胞樣簇中表達(dá)突出，如 A0、A1、A5 和 A12（圖 4F；圖3）。在內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞中表達(dá)的最主要的WNT受體是FZD6和LRP6。總之，scRNA-seq 分析發(fā)現(xiàn)了子宮內(nèi)膜和子宮腺肌癥中各種成纖維細(xì)胞群的重要作用，它們似乎通過向內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞傳遞 WNT 信號(hào)，在子宮腺肌癥的病理生理學(xué)中發(fā)揮著核心作用。

圖4 子宮腺肌病和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞譜分析

實(shí)驗(yàn)方法：

患者信息和臨床樣本采集，scRNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析

參考文獻(xiàn)：

Yildiz S, Kinali M, Wei JJ, Milad M, Yin P, Adli M, Bulun SE. Adenomyosis: single-cell transcriptomic analysis reveals a paracrine mesenchymal-epithelial interaction involving the WNT/SFRP pathway. Fertil Steril. 2023 May;119(5):869-882. doi: 10.1016/j.fertnstert.2023.01.041. Epub 2023 Feb 1. PMID: 36736810.