NSUN2通過增強(qiáng)SKIL mRNA的穩(wěn)定性促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展

         NSUN2是催化m5C形成的重要RNA甲基轉(zhuǎn)移酶之一，參與許多關(guān)鍵的生物過程。然而，NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在結(jié)直腸癌(CRC)中的作用和潛在的分子機(jī)制尚不清楚。NSUN2在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與結(jié)直腸癌患者生存不良相關(guān)。此外，在NSUN2敲除小鼠模型中，沉默NSUN2抑制CRC腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。體外和體內(nèi)研究表明，NSUN2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。從機(jī)制上講，SKIL受NSUN2的正調(diào)控，NSUN2-SKIL軸與結(jié)直腸癌有臨床相關(guān)性。NSUN2誘導(dǎo)SKIL的m5C修飾并穩(wěn)定其mRNA，該修飾由YBX1介導(dǎo)。升高的SKIL水平增加了TAZ的的激活。我們的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了NSUN2通過m5C-YBX1依賴性的SKIL轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定化在CRC的發(fā)生和進(jìn)展中的重要性，為CRC提供了一種有希望的靶向治療策略。本文于2024年2月發(fā)表于“Clin Transl Med”（IF=10.6）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）結(jié)直腸癌組織中NSUN2的過表達(dá)與患者生存和腫瘤發(fā)生有關(guān)

         為了探索mRNA m5C修飾在CRC中的作用，我們?cè)u(píng)估了TCGA的CRC隊(duì)列中主要mRNA m5C甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平(圖1A)。NSUN6、NSUN7、TRDMT1在結(jié)直腸腫瘤組織與鄰近正常組織中的表達(dá)無(wú)明顯差異。有趣的是，NSUN2在腫瘤中的表達(dá)水平高于正常組織。這些發(fā)現(xiàn)也在不同的CRC數(shù)據(jù)集中得到了驗(yàn)證，包括GSE20916、GSE33113和GSE8671(圖1A)。此外，在新鮮采集的結(jié)直腸癌組織中也發(fā)現(xiàn)了NSUN2的過表達(dá)(圖1B、C)。Kaplan-Meier生存分析顯示，NSUN2高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的總生存率(OS)低于NSUN2低表達(dá)的結(jié)直腸癌患者(圖1D)。接下來(lái)，我們產(chǎn)生了NSUN2敲除小鼠(NSUN2-/-)來(lái)研究NSUN2在CRC中的作用。我們建立了CRC模型(圖1E)。正如預(yù)期的那樣，Nsun2-/-小鼠比Nsun2+/+小鼠產(chǎn)生的腫瘤更小，更少(圖1F-H)。組織病理學(xué)分析顯示，與Nsun2-/小鼠相比，Nsun2+/+小鼠的結(jié)直腸腫瘤分期較早(圖1I)，表明NSUN2在結(jié)直腸癌的致瘤性和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

2）NSUN2促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展

         為了研究NSUN2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞行為的影響，我們用shRNA敲除NSUN2，并通過western blotting測(cè)定其效率。通過集落形成實(shí)驗(yàn)探討NSUN2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。如圖2A和B所示，NSUN2的缺失抑制了細(xì)胞增殖，而過表達(dá)NSUN2則表現(xiàn)出相反的效果。此外，重新引入NSUN2可以挽救CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖2C)。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，NSUN2促進(jìn)了集落形成能力(圖2D-F)。我們還發(fā)現(xiàn)，NSUN2敲低后，遷移細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(圖2G)。相反，上調(diào)NSUN2可增加細(xì)胞遷移能力(圖2H)。拯救實(shí)驗(yàn)表明，NSUN2參與促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移，進(jìn)一步證實(shí)了NSUN2的致瘤作用(圖2I)。將穩(wěn)定感染的DLD1細(xì)胞接種于裸鼠側(cè)翼，觀察NSUN2對(duì)異種移植瘤生長(zhǎng)的影響。與對(duì)照組相比，NSUN2敲低組腫瘤的大小和重量明顯減小，這可以通過重新引入NSUN2來(lái)挽救(圖2J-L)。總的來(lái)說，這些結(jié)果表明NSUN2在體內(nèi)和體外都能促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。

3）NSUN2刺激CRC中SKILL的表達(dá)

         在NSUN2敲低或過表達(dá)的CRC細(xì)胞中，免疫熒光檢測(cè)顯示m5C熒光信號(hào)與NSUN2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(圖3A, B)，表明NSUN2對(duì)CRC細(xì)胞中m5C的修飾水平起作用。因此，為了確定參與NSUN2介導(dǎo)的CRC進(jìn)展的下游效應(yīng)物，我們使用RNA測(cè)序和亞硫酸鹽測(cè)序(RNA-bisseq)數(shù)據(jù)評(píng)估了潛在靶點(diǎn)。重疊后，有14個(gè)潛在目標(biāo)(圖3C)。其中，ATF3、CDK9、HEY1、CBX4、ITGB1、SKIL為癌基因，而SETD2作為腫瘤抑制基因。然而，當(dāng)我們使用不同的細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，在DLD1細(xì)胞、HCT116細(xì)胞和HT-29細(xì)胞中，NSUN2敲低后，只有SKIL表達(dá)水平持續(xù)降低(圖3D)。NSUN2缺失顯著降低了SKIL mRNA和蛋白水平，而NSUN2過表達(dá)產(chǎn)生相反的結(jié)果(圖3D和)。Nsun2+/+小鼠的SKIL表達(dá)水平高于Nsun2-/-小鼠(圖3E)。生物信息學(xué)分析顯示，CRC中SKIL表達(dá)上調(diào)(圖3F)。臨床上，SKIL表達(dá)水平高的患者預(yù)后較差(圖3G)。為了進(jìn)一步評(píng)估NSUN2和SKIL之間的臨床相關(guān)性，我們檢測(cè)了它們?cè)谝唤M結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)譜。結(jié)果顯示，NSUN2高表達(dá)的腫瘤組織具有較高的SKIL水平(圖3H, I)。此外，我們對(duì)組織微陣列(TMA)進(jìn)行了免疫組化染色。NUSN2與SKIL在臨床表現(xiàn)為顯著正相關(guān)(圖3J、K)。

4）NSUN2通過SKIL促進(jìn)CRC細(xì)胞的惡性表型

         為了揭示NSUN2-SKIL軸的功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了拯救實(shí)驗(yàn)。SKIL過表達(dá)恢復(fù)了NSUN2敲低對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、集落形成和遷移的抑制作用(圖4A-C)。用或不加shNSUN2和PLVX-SKIL處理的DLD1細(xì)胞接種于裸鼠側(cè)翼。結(jié)果顯示，NSUN2敲低抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低腫瘤重量和Ki67表達(dá)水平，而SKIL過表達(dá)恢復(fù)了這些作用(圖4D-G)。總之，SKIL是NSUN2促進(jìn)結(jié)直腸癌惡性的關(guān)鍵靶點(diǎn)。 

5）NSUN2甲基化以YBX1依賴的方式穩(wěn)定SKIL mRNA

         接下來(lái)，我們探討了NSUN2的致癌功能是否取決于其m5C甲基轉(zhuǎn)移酶活性。通過在NSUN2沉默細(xì)胞中過表達(dá)NSUN2野生型(WT)和突變型質(zhì)粒，我們發(fā)現(xiàn)只有野生型能夠挽救CRC細(xì)胞的增殖和集落形成，而酶促死亡的NSUN2突變體則不起作用(圖5A)。此外，過表達(dá)WT而非突變型NSUN2在NSUN2敲除細(xì)胞中恢復(fù)了SKIL mRNA和蛋白質(zhì)水平(圖5B)。接下來(lái)，我們發(fā)現(xiàn)m5C抗體可以有效地富集SKIL mRNA(圖5C)。此外，沉默NSUN2降低了CRC細(xì)胞中SKIL的m5C水平，這可以通過過表達(dá)WT而不是突變的NSUN2來(lái)挽救(圖5D)。由于m5C修飾可以調(diào)節(jié)靶mRNA的穩(wěn)定性，為了確定NSUN2介導(dǎo)的m5C如何調(diào)節(jié)SKIL mRNA的表達(dá)，我們用放線菌素D處理CRC細(xì)胞。如圖5E所示，NSUN2沉默顯著降低了SKIL mRNA的半衰期。這種減少可以通過過表達(dá)野生型而非突變型NSUN2來(lái)恢復(fù)(圖5F)，這表明NSUN2通過m5C修飾增強(qiáng)其mRNA的穩(wěn)定性來(lái)上調(diào)SKIL。

         YBX1是一種重要的m5C讀取器，已被證明通過招募ELAVL1維持mRNA穩(wěn)定性。RIP實(shí)驗(yàn)顯示YBX1可以與SKIL mRNA結(jié)合(圖5G)，并且這種相互作用在NSUN2沉默的細(xì)胞中減少(圖5H)，表明YBX1可能是SKIL的m5C讀取器。進(jìn)一步研究表明，shYBX1可通過降低CRC細(xì)胞中SKIL mRNA的穩(wěn)定性來(lái)降低SKIL的表達(dá)水平(圖5I, J)。沉默YBX1可抑制NSUN2對(duì)SKIL表達(dá)的激活(圖5K, L)。綜合上述結(jié)果，我們得出結(jié)論，NSUN2可通過增加CRC細(xì)胞中SKIL mRNA的穩(wěn)定性，以依賴于YBX1的方式上調(diào)SKIL的表達(dá)。

6）NSUN2誘導(dǎo)SKIL-TAZ軸促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生

         YAP/TAZ是密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與不同類型癌癥的進(jìn)展。我們?cè)噲D確定NSUN2是否影響SKIL-TAZ軸。如圖6A, B所示，NSUN2過表達(dá)增加了TAZ蛋白水平，而NSUN2敲低抑制了TAZ蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，NSUN2沉默可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中TAZ靶基因的表達(dá)(圖6C)。NSUN2敲低增加了TAZ蛋白的周轉(zhuǎn)率(圖6D)。此外，SKIL過表達(dá)部分恢復(fù)了NSUN2缺失細(xì)胞中TAZ表達(dá)及其靶點(diǎn)的激活，表明NSUN2調(diào)節(jié)了SKIL-TAZ軸(圖6E, F)。隨后，我們?cè)噲D在患者來(lái)源的異種移植(PDX)模型中確定NSUN2介導(dǎo)的TAZ調(diào)節(jié)的臨床相關(guān)性。為此，在測(cè)量了NSUN2的表達(dá)水平后(圖6G)，我們將從CRC患者中切除的新鮮原發(fā)腫瘤樣本植入免疫功能低下的小鼠體內(nèi)，然后腹腔注射PBS或維替泊芬(一種YAP/TAZ-TEAD介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄干擾物)(圖6H)。值得注意的是，給藥維替泊芬可以減緩NSUN2高的PDX腫瘤的進(jìn)展(病例1和2)。相反，維替泊芬對(duì)NSUN2低的PDX腫瘤的生長(zhǎng)和體重影響很小(病例3和4;圖6I, J)。

結(jié)論：

         NSUN2通過促進(jìn)SKIL mRNA的穩(wěn)定，進(jìn)而促進(jìn)TAZ的激活，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的惡性發(fā)展。

實(shí)驗(yàn)方法：

         AOM-DSS小鼠模型構(gòu)建；裸鼠異種移植瘤模型；PDX模型；免疫印跡法；免疫組化；免疫熒光；RT-PCR；細(xì)胞增殖和集落形成試驗(yàn)；transwell。

參考文獻(xiàn)：

         Zou S, Huang Y, Yang Z, Zhang J, Meng M, Zhang Y, Feng J, Sun R, Li W, Wang W, López JG, Fang L. NSUN2 promotes colorectal cancer progression by enhancing SKIL mRNA stabilization. Clin Transl Med. 2024 Mar;14(3):e1621. doi: 10.1002/ctm2.1621.