肝癌細(xì)胞分泌外泌體microRNA-103增加了血管通透性并通過靶向連接蛋白促進(jìn)轉(zhuǎn)移

肝癌細(xì)胞分泌外泌體microRNA-103增加了血管通透性并通過靶向連接蛋白促進(jìn)轉(zhuǎn)移

血管通透性增加有助于癌癥轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)表明，分泌型microRNA可能介導(dǎo)癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的串?dāng)_。迄今為止，分泌型miRNA是否影響及如何影響血管通透性尚不清楚。近日，中山大學(xué)生命科學(xué)院莊詩美教授在《Hepatology》(IF=13.246）雜志上發(fā)表的文章揭示了分泌型miRNA影響血管通透性的機(jī)制。研究人員首先通過測(cè)序和定量PCR，血清miR-103水平與肝細(xì)胞癌（HCC）轉(zhuǎn)移潛能正相關(guān)。體外內(nèi)皮通透性和跨內(nèi)皮侵襲測(cè)定結(jié)果顯示，來自miR-103高表達(dá)肝癌細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或外泌體增加了內(nèi)皮通透性，但如果通過沉默ALIX和HRS阻斷肝細(xì)胞瘤細(xì)胞的外泌體分泌或拮抗肝細(xì)胞瘤或內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的miR-103，則該作用減弱。最重要的是，用穩(wěn)定表達(dá)miR-103的肝癌細(xì)胞分泌的外泌體孵育單層內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的跨內(nèi)皮侵襲，并且這種外泌體的作用可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-103而被抑制。進(jìn)一步體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)miR-103的肝癌細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出更高的腫瘤血管通透性，更高的外泌體miR-103表達(dá)且其血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量更多，肝和肺轉(zhuǎn)移率增加。機(jī)制研究表明，肝癌細(xì)胞分泌的miR-103可能通過外泌體傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞中，然后通過直接抑制VE-Cadherin、p120和ZO-1的表達(dá)來減弱內(nèi)皮連接的完整性。此外，miR-103還可通過抑制p120在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。這項(xiàng)研究表明，肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-103通過靶向多種內(nèi)皮連接蛋白增加血管通透性并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，并突出了分泌的miR-103可作為潛在的治療靶標(biāo)和HCC轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)標(biāo)記物。

技術(shù)路線

1. 發(fā)現(xiàn)miR-103

2. 體內(nèi)體外驗(yàn)證

研究結(jié)果

1.     肝癌細(xì)胞分泌的miR-103增加單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性并促進(jìn)體外腫瘤細(xì)胞的跨內(nèi)皮侵襲

圖1. HCC患者血清和肝癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基中miR-103的檢測(cè)。

（A）血清miR-103水平升高與HCC復(fù)發(fā)率較高有關(guān)。

（B）轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞表達(dá)并分泌高水平的miR-103。

圖2.肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-103增加單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性并促進(jìn)體外腫瘤細(xì)胞的跨內(nèi)皮侵襲。

（A）用QGY-7703衍生的外泌體預(yù)處理的HUVEC單層，滲透性增加。

（B）用來自miR-103穩(wěn)定表達(dá)的LO2或HepG2細(xì)胞的外泌體預(yù)處理的HUVEC單層，通透性增加。

（C）拮抗內(nèi)源性miR-103或阻斷QGY-7703細(xì)胞的外泌體分泌減弱了QGY-7703衍生的外泌體增強(qiáng)內(nèi)皮通透性的能力。

（D）在HUVEC中拮抗miR-103減弱了QGY-7703衍生的外泌體增加內(nèi)皮通透性的能力。

（E）miR-103穩(wěn)定表達(dá)肝癌細(xì)胞外泌體預(yù)處理HUVEC單層侵襲能力更強(qiáng)。

（F）在HUVEC中拮抗miR-103減弱了QGY-miR-103衍生的外泌體增加癌細(xì)胞的跨內(nèi)皮侵襲的能力。

2.     肝癌細(xì)胞分泌的miR-103增加血管通透性并促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移

圖3肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-103增加血管通透性并促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

（A）攜帶源自QGY-miR-103腫瘤的小鼠血漿中的外泌體的miR-103水平增加。

（B-C）QGY-miR-103-腫瘤脈管系統(tǒng)表現(xiàn)出較高的滲透性。

（D）攜帶QGY-miR-103腫瘤的小鼠循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量增加。

（E-F）攜帶QGY-miR-103腫瘤的小鼠，轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)。

3.         肝癌細(xì)胞分泌的miR-103通過外泌體被遞送到內(nèi)皮細(xì)胞中

圖4.肝癌細(xì)胞分泌的miR-103通過外泌體遞送入內(nèi)皮細(xì)胞。

（A）與QGY-7703細(xì)胞衍生的外泌體孵育的HUVECs中成熟miR-103的水平增加。

（B）在QGY-7703細(xì)胞中拮抗內(nèi)源性miR-103減弱了QGY-7703衍生的外泌體在HUVEC中增加miR-103水平的能力。

（C）阻斷QGY-7703細(xì)胞的外泌體分泌減弱了QGY-7703衍生的外泌體提高HUVEC中miR-103水平的能力。

（D）外泌體miR-103被內(nèi)化到HUVEC中。

4.         肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-103通過靶向VE-Cad，p120和ZO-1，減弱了內(nèi)皮細(xì)胞的連接完整性

圖5.肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-103減弱了HUVEC單層的內(nèi)皮連接完整性。

（A）用HepG2-miR-103衍生的外泌體處理的HUVEC單層VE-Cad，p120和ZO-1表達(dá)的顯著降低。

（B）在QGY-7703細(xì)胞中拮抗內(nèi)源性miR-103減弱了QGY-7703衍生的外泌體降低HUVEC單層中VE-Cad，p120和ZO-1表達(dá)的能力。

（C）在HUVEC中拮抗miR-103減弱了QGY-7703衍生的外泌體降低VE-Cad，p120和ZO-1表達(dá)的能力。

圖6.肝癌細(xì)胞分泌的miR-103直接抑制受體HUVEC中VE-Cad，p120和ZO-1的表達(dá)。

（A-C）用來自miR-103穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的外泌體處理的HUVEC細(xì)胞中VE-Cad，p120和ZO-1的蛋白水平降低。

（D）在QGY-7703細(xì)胞中拮抗內(nèi)源性miR-103減弱了QGY-7703衍生的外泌體降低HUVEC中VE-Cad，p120和ZO-1表達(dá)的能力。

（E）在HUVEC中拮抗miR-103減弱了QGY-7703衍生的外泌體降低VE-Cad，p120和ZO-1表達(dá)的能力。

（F）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-103靶向結(jié)合VE-Cad，p120和ZO-1。

圖7.miR-103通過減弱p120-E-Cad信號(hào)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移。

（A-B）miR-103的增加減少了肝癌細(xì)胞中p120和E-Cad蛋白的表達(dá)。

（C-D）轉(zhuǎn)染miR-103促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的遷移。

（E-F）拮抗內(nèi)源性miR-103增加了p120和E-Cad水平，抑制肝癌細(xì)胞的遷移。