ChIP染色質(zhì)免疫共沉淀

 染色質(zhì)免疫共沉淀

研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DN***段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。

ChIP實(shí)驗(yàn)操作流程：
1、樣品準(zhǔn)備與交聯(lián)
細(xì)胞收集后，用1%的formaldehyde處理細(xì)胞，交聯(lián)核酸與DNA結(jié)合蛋白；
2.超聲打斷染色質(zhì)
裂解細(xì)胞，用超聲波將染色質(zhì)超聲破碎成200－1000bp片斷；將片段分為兩份，一份用于免疫共沉淀，一份用于對(duì)照。
　　　 　
                                

     圖1染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)流程           圖2　超聲破碎后DNA電泳圖（lane2） 

3、免疫共沉淀(IP)
取B步驟所得一份片斷與ChIP特異抗體結(jié)合進(jìn)行免疫共沉淀，利用免疫磁珠法富集抗體復(fù)合物。
4、解交聯(lián)及純化DNA
將富集的DNA/蛋白復(fù)合物解交聯(lián)釋放DNA片段，并進(jìn)行純化（IP DNA）；B步驟所得用于對(duì)照（Input DNA）的片斷作不進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，但也要解交聯(lián)并純化。
5、DNA段PCR擴(kuò)增
針對(duì)ChIP DNA, Input DNA及對(duì)照DNA的目的片段設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。
 6、結(jié)果分析
%Input=2(CtInput-CtChIP)×Fd×100%
Fold Enrichment = [%(ChIP/Input)] / [%( Negative control/Input)]