抑癌基因PTEN與可變剪接相關(guān)性研究的重大發(fā)現(xiàn)

前體mRNA的可變剪切與腫瘤密切相關(guān)，然而可變剪切與致癌基因以及抑癌因子之間的關(guān)系還仍不明確。2018年6月，上海交通大學(xué)細(xì)胞分化和凋亡教育部重點實驗室沈少明博士和上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所冀顏博士為論文第一作者在《Nature Communication》（IF=12.353）發(fā)表了題為“Nuclear PTEN safeguards pre-mRNA splicing to link Golgi apparatus for its tumor suppressive role.”的文章，報道了存在于細(xì)胞核內(nèi)PTEN蛋白通過與mRNA剪接體相互作用，調(diào)控pre-mRNA的可變剪接，進(jìn)而干預(yù)高爾基體的伸展和分泌，從而發(fā)揮其腫瘤抑制作用。

技術(shù)路線

結(jié)果

圖1 PTEN調(diào)節(jié)整體的可變剪切。

構(gòu)建pMTE1A minigene或者 pTN24熒光素酶報告基因，并將其轉(zhuǎn)入到PTEN+/+ 以及PTEN-/-小鼠胚胎成纖維(MEF) 細(xì)胞中，均證明PTEN的缺失會影響剪切事件（a, b）；利用shRNA干擾PTEN的表達(dá)后通過RNA-seq檢測與對照組相比檢測下游靶基因的變化，262 可變剪接事件(ASEs) 代表 208 人類基因被檢測出來，并且通過RT-PCR得以驗證。

圖2 PTEN調(diào)節(jié)的 ASEs在腫瘤中得以證實。

利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)上述的262個基因絕大多數(shù)與腫瘤有關(guān)，其中我們挑出與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBMLGG)相關(guān)的20個基因（a, b）；12個基因與腫瘤以及ASEs均相關(guān)，16個與病人的生存具有相關(guān)性（c, d），三者交叉共有10個基因被挑選出來做進(jìn)一步研究（e，f）；在PTEN缺失與野生型的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中證實了GOLGA2, KIF21A ,C2CD5的表達(dá)。

圖3 核PTEN 與剪接復(fù)合體蛋白相互作用。

293T細(xì)胞的核提取物進(jìn)行尺寸排阻色譜分析得到了PTEN可能被招募到高分子的復(fù)合體（a）免疫沉淀結(jié)合LC-MS/MS鑒定到136個與核PTEN相互作用的蛋白質(zhì)（b），KEGG 分析得到38個屬于剪接體的組成成分（c）。通過細(xì)胞核質(zhì)分離并結(jié)合co-IP以及pull-down實驗證實了核PTEN與剪接體蛋白緊密結(jié)合并且調(diào)控剪接體組裝（e，d，f）。

圖4 PTEN能夠與剪接體蛋白U2AF2的RS結(jié)構(gòu)域直接相互作用。

利用qRT-PCR檢測到 U2 與MEF細(xì)胞中PTEN的缺失有關(guān)（a）揭示了PTEN可能與U2 snRNP復(fù)合物的組裝有關(guān)；co-IP 以及HPM 的交叉分析，并通過String database得到剪接復(fù)合體的互作網(wǎng)絡(luò)GST-標(biāo)簽的 PTEN 蛋白與His-標(biāo)簽的U2AF2共孵育進(jìn)行GST pulldown實驗證實兩者的互作（c）刪除aa27–62, 精氨酸U2AF2絲氨酸富富集的區(qū)域(RS) 能調(diào)節(jié)U2AF2–PTEN 相互作用(d) 并且在PTEN+/+ 以及PTEN-/- MEF細(xì)胞在體內(nèi)水平進(jìn)行了驗證（e，f，g）

圖5 PTEN的敲除誘導(dǎo)了GOLGA2 的可變剪切，促進(jìn)了高爾基體伸展與分泌功能。

高爾基體相關(guān)功能基因GOLGA2的可變剪接是核PTEN所調(diào)控的可變剪接事件之一。PTEN缺失使得其在新定義的外顯子2b處發(fā)生剪接跳躍，產(chǎn)生了更多不含有外顯子2b的變體（a，b）；利用ASO引起的外顯子2b處發(fā)生剪接跳躍，IF免疫熒光證實了高爾基體變得更加的伸展（d）同樣的在PTEN-/- MEF 細(xì)胞以及PTEN 敲減的DU145細(xì)胞內(nèi)也如此。TEM電鏡也觀察到PTEN表達(dá)缺失后導(dǎo)致的高爾基體的分泌功能減弱（g）。外顯子2b的變體這一可變剪接事件的發(fā)生使得高爾基體變得更為伸展，分泌功能大幅增強(qiáng)（h，i）。

圖6 通過GOLGA2 的剪接跳躍導(dǎo)致了PTEN缺失腫瘤的生長優(yōu)勢。

利用ts045-VSVG-EGFP（具有從ER移出到高爾基復(fù)合體中的能力，并且在溫度降低到32℃時最終到達(dá)質(zhì)膜，因此已被廣泛用于研究膜轉(zhuǎn)運）研究高爾基體分泌，結(jié)果顯示PTEN缺失促進(jìn)高爾基體分泌（a，b，c，d）ASO電穿孔轉(zhuǎn)化以及PTEN的干擾實驗也證明了這一點（e，f，g）進(jìn)一步研究了GOLGA2S對腫瘤生長的影響。發(fā)現(xiàn)PTEN缺失促進(jìn)腫瘤生長，敲低GOLGA2S也會抑制這種生長現(xiàn)象（h，i，j），因此GOLGA2剪接有助于PTEN缺失誘導(dǎo)的分泌和腫瘤生長

圖7 PTEN敲除能使得癌細(xì)胞對分泌抑制劑敏感。

接著研究人員用兩種分泌抑制劑BFA和GCA處理PTEN+/+和PTEN-/- MEF細(xì)胞。結(jié)果顯示，一旦達(dá)到一定的濃度（BFA為1μg/ ml，GCA為8μg/ ml），BFA和GCA對PTEN-/- 細(xì)胞抑制作用更明顯，表明分泌抑制劑BFA和GCA能夠選擇性地殺死PTEN缺失的腫瘤細(xì)胞。