附睪精子過渡期間獲得的small RNA對(duì)小鼠胚胎發(fā)育至關(guān)重要

哺乳動(dòng)物精子裝載的 small RNA在發(fā)育過程中發(fā)生顯著改變，因?yàn)樵诟讲G的睪丸后成熟過程中，幾波microRNA和tRNA片段被運(yùn)送到精子。近日，來自美國(guó)馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員Rando在DEVELOPMENTAL CELL（IF=9.616）發(fā)表了一篇題為“Small RNAs Gained during Epididymal Transit of Sperm Are Essentialfor Embryonic Development in Mice”的文章，他們利用這一發(fā)育過程來探測(cè)精子RNA有效載荷在胚胎植入前發(fā)育中的功能。他們使用從近端（頭部）與遠(yuǎn)端（尾部）附睪獲得的精子通過卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）產(chǎn)生受精卵，然后記錄所得胚胎發(fā)育的表型特征。使用頭部精子產(chǎn)生的胚胎在整個(gè)植入前發(fā)育過程中顯著過度表達(dá)多種調(diào)節(jié)因子，隨后植入效率低下，并且在植入后很快失敗。值得注意的是，將純化的附睪尾部特異性小RNA顯微注射到頭部衍生的胚胎中不僅完全挽救了植入前的分子缺陷，而且還抑制了植入后的胚胎致死性表型。這些發(fā)現(xiàn)揭示了哺乳動(dòng)物精子睪丸后成熟過程中小RNA重塑的重要作用，并確定了對(duì)精子傳遞的microRNAs有反應(yīng)的特定植入前基因表達(dá)程序。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1 多個(gè)表觀遺傳調(diào)控因子在附睪頭部來源精子產(chǎn)生的胚胎中（4細(xì)胞，8細(xì)胞）的過度表達(dá)。

圖1 實(shí)驗(yàn)路線

（A）從近端（頭部）和遠(yuǎn)端（尾部）附睪獲得的精子攜帶不同的小RNA群（Nixon et al，2015; Sharma et al ，2016）。（B）不同精子來源（ICSI）的胚培養(yǎng)到指定階段并進(jìn)行RNA-seq. （C）2細(xì)胞階段合子基因組激活（ZGA）的主要波。平均mRNA豐度的散點(diǎn)圖（對(duì)于18小時(shí)胚胎（前ZGA，x軸）與28小時(shí)胚胎（后ZGA，y軸）平均值相比，差異表達(dá)的基因（ p <0.05）顯示為紅色和綠色圓點(diǎn)。（D）2細(xì)胞階段合子（附睪頭部和尾部精子來源）18、28小時(shí)胚胎顯著ZGA基因的熱圖。（E、F）Caput與Cauda胚胎在18小時(shí)（E）和28小時(shí)（F）的平均mRNA豐度（如C）的散點(diǎn)圖，顯示無顯著差異。

圖2 睪丸后精子成熟對(duì)植入前基因調(diào)控的影響

（A）附睪頭部和尾部的精子產(chǎn)生的胚全部基因表達(dá)對(duì)比散點(diǎn)圖，紅色點(diǎn)為37個(gè)顯著差異基因（P<0.05）（B）在頭部胚胎中過表達(dá)的8個(gè)基因與尾部胚胎在單個(gè)4細(xì)胞胚胎的數(shù)據(jù)。黑條顯示每組的中值表達(dá)胚胎。 *，**和***分別顯示調(diào)整后的p值低于0.1,0.01和0.001。（C）4細(xì)胞胚后期的基因表達(dá)差異。（D）在所有階段95個(gè)基因差異表達(dá)(p adj <0.1)熱圖。

2 Caput-Derived胚胎在植入后發(fā)育中表現(xiàn)出多重缺陷。

圖3附睪頭部的精子在移植后早起發(fā)育失敗

（A）   胚胎移植的實(shí)驗(yàn)示意圖。（B）睪丸精子和尾部附睪精子都能夠支持從受精到出生的類似胚胎發(fā)育，而頭顱精子獨(dú)特地引起調(diào)節(jié)和發(fā)育畸變。Caput和Cauda胚胎的成功率.（C）各自用Cauda或Caput胚胎轉(zhuǎn)移,從一只雌性中解剖的所有胚胎的圖像。（D）所有胚胎移植解剖的定量分析。

3 睪丸精子和Cauda附睪精子都能夠支持從受精到出生的類似胚胎發(fā)育，而Caput附睪精子獨(dú)特地引起調(diào)節(jié)和發(fā)育畸變。

圖4 睪丸來源精子產(chǎn)生的胚的分子機(jī)制分析

（A）   睪丸來源精子ICSI 過程概要。（B）睪丸精子來源和Canda 附睪來源的胚4細(xì)胞時(shí)期基因表達(dá)的比較。（C-D）比較了4個(gè)細(xì)胞（C）和胚泡（D）階段的Cauda和睪丸胚胎之間的mRNA豐度（所有基因的中值tpm> 10）散點(diǎn)圖。

4在附睪過渡期間獲得的small RNAs挽救Caput-Derived胚的缺陷。

圖5 Cauda特異性的miRNA恢復(fù)Cauda胚的生長(zhǎng)。

（A）Cauda特異性的miRNA純化和微注射概要圖。（B）Cauda特異表達(dá)抑制的 RNA 過表達(dá)在Caput-derived胚。（C）Caput對(duì)mRNA豐度的影響（x軸，log 2倍變化Caput / Cauda）對(duì)小RNA注射的影響（y軸，log 2倍變化）的散點(diǎn)圖。

5 Cauda特異性small RNAs拯救了Caput-Derived胚胎的發(fā)育。

圖6  Cauda特異性MicroRNAs，而不是tRFs，可以挽救Caput植入前的缺陷

（A）   MicroRNAs, tRFs 微注射實(shí)驗(yàn)概況。（B）附睪體RNA的純化。 從Cauda附睪體中純化的兩個(gè)重復(fù)總RNA樣品的丙烯酰胺電泳。 框顯示了用于微小RNA和tRF的凝膠純化的邊界。（C）單個(gè)4細(xì)胞期Cauda（n = 23），Caput（n = 23），Caput + microRNA（n = 22）和Caput + tRF（n = 21）胚胎的mRNA豐度，代表性Caput –上調(diào)基因。（D）比較Caput效應(yīng)（x軸）和microRNA效應(yīng)（y軸）對(duì)4細(xì)胞期胚胎中mRNA豐度的散點(diǎn)圖（E-F）在4細(xì)胞期胚胎（E）和胚泡階段（F）microRNA和tRF對(duì)Caput上調(diào)基因影響的直方圖。

圖7 Cauda特異性小RNAs拯救Caput胚胎的發(fā)展
（A）Small RNA注射流程圖。（B）圖像顯示了由用RNA顯微注射的頭部衍生胚胎產(chǎn)生的成功的實(shí)例。下表列出了成功率，如圖3B所示。