Prodrug suicide gene therapy for cancer targeted intracellular by mesenchymal stem cell exosomes

間充質(zhì)干細胞（MSCs）及其外泌體由于其靶向腫瘤中的天然行為被認為是一種有前景的治療方法。近日，來自斯洛伐克科學(xué)院的Altaner和他的團隊在INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER（IF=7.36）在線發(fā)表了題目“Prodrug suicide gene therapy for cancer targeted intracellular by mesenchymal stemcell exosomes”的文章，他們設(shè)計自殺基因yCD::UPRT在各種人體組織制備的MSCs表達。該自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的CM包含外泌體，載著自殺基因的mRNA。該外泌體很容易被腫瘤細胞內(nèi)化，在前體藥物5-氟胞嘧啶（5-FC）的存在下，攜帶自殺基因的外泌體可以使腫瘤細胞以劑量依賴性的方式死亡。根據(jù)他們的檢測，由MSC和自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC產(chǎn)生的外來體中微小RNA的存在沒有顯著差異，與治療效果無關(guān)。 攜帶自殺基因MSC外泌體代表了一類新的腫瘤細胞靶向藥物在細胞內(nèi)起作用并具有治愈潛力。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1 從各種人組織獲得的MSC可以用CD :: UPRT自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖1 貫穿整個工作的實驗步驟。

（A，B）從各種組織中分離和擴增MSC;（C）攜帶yCD :: UPRT或tk / HSV自殺基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MSCs; （D）選擇自殺基因轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的細胞群;（E）收獲有條件的媒介;（F）從CM中分離外泌體;（G）檢測外泌體貨物中自殺基因的mRNA;（H）用CM和yCD :: UPRT-外泌體抑制腫瘤細胞生長;（I）CM，外泌體和LMWC對腫瘤細胞遷移的影響; （J）MSCs和yCD :: UPRT-MSC外泌體中miRNA的表達譜。

2 與相應(yīng)MSCs相比，不同來源yCD::UPRT-MSCs對條件培養(yǎng)基腫瘤細胞生長抑制效應(yīng)更加顯著。

圖2 yCD :: UPRT基因在同源培養(yǎng)的yCD :: UPRT- MSCs中的表達

（A）PCR擴增來自yCD :: UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的分離的細胞DNA。 凝膠分辨率證實了特定序列的存在（B）通過Nanosight檢測從yCD :: UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC釋放的外泌體;（C）來自yCD :: UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的分離的經(jīng)DNase處理的總RNA被逆轉(zhuǎn)錄并進行PCR擴增。 通過瓊脂糖凝膠電泳顯現(xiàn)特定轉(zhuǎn)錄物的存在。（D）qRT-PCR估計各種yCD :: UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的細胞DNA中整合的DNA yCD :: UPRT基因的相對拷貝數(shù)。（E）qRT-PCR估計來自yCD :: UPRT轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的外來體中mRNA的相對表達;（F）外來體貨物中yCD :: UPRT基因的mRNA與腫瘤細胞生長抑制活性的比較。

3 來自yCD::UPRT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)不同組織來源的MSCs的CM, LMWC, 外泌體的不同腫瘤細胞生長抑制療效不同。

圖3 不同MSCs外泌體表達yCD::UPRT基因的對腫瘤細胞生長抑制活性的評估。

（A）刺激了在不存在前藥b5-FC的情況下用來自yCD :: UPRT-AT-MSC的CM處理的PC3細胞的生長，但未檢測到HeLa1a細胞的生長刺激。（B）在5-FC存在下，用來自yCD :: UPRT-AT-MSC的CM處理的人前列腺腫瘤細胞PC3的生長被劑量依賴性地抑制; （C）人乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長在5-FC存在下以劑量依賴性地被抑制，但是在沒有5-FC的情況下沒有影響他們的成長; （D）大鼠膠質(zhì)母細胞瘤細胞C6被來自yCD :: UPRT-MB-MSC的CM有效殺死，并被yCD :: UPRT-BM-MSC部分殺死。（E）在5-FC存在下，yCD :: UPRT-MSC的CM中外泌體的腫瘤細胞死亡功效的比較(與具有相同蛋白質(zhì)含量值（50μg）的CM樣品)。

圖4 yCD中CM的篩析::UPRT-AT-MSCs和外泌體的腫瘤細胞特異性。

(A) CM與yCD::UPRT-AT-MSCs分離;(B)不同yCD::UPRT轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs中CM的特異性。

4 MSCs及相應(yīng)的yCD::不同組織來源的UPRT-MSCs的microrna的表達沒有顯著不同。

圖5 未轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC外泌體和yCD:: uprt -基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中外泌體差異表達的mirna表達譜。

(A)根據(jù)組織類型和是否存在yCD::UPRT基因，對2549個微陣列中檢測到的microRNAs(綠柱)數(shù)量進行比較。(B)基于子集(276 miRNA，至少在75%的樣品中表達;)液的檢測小分子核糖核酸釋放不同的組織起源MSC和相應(yīng)的yCD::UPRT gene-transduced MSC之間的表達差異(BH調(diào)整p值> 0.05)。