MicroRNA-30家族成員通過(guò)直接靶向多個(gè)骨轉(zhuǎn)移相關(guān)基因來(lái)抑制乳腺癌侵襲、骨擬態(tài)和骨質(zhì)破壞

miRNAs是基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子，在癌癥轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。在骨轉(zhuǎn)移期間，轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞必須重新連接其生物學(xué)并表達(dá)通常由骨細(xì)胞表達(dá)的基因（稱為骨擬態(tài)過(guò)程），其賦予腫瘤細(xì)胞在骨髓中充分生長(zhǎng)的能力。2018年7月24號(hào)，法國(guó)國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究院（INSERM）的研究人員建立了miR-30家族成員miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e作為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的抑制因子，這些抑制因子調(diào)控多種途徑，包括骨擬態(tài)。miR-30家族在乳腺癌患者原發(fā)性腫瘤中的低表達(dá)與無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)。另外，雌激素受體（ER）-陰性/孕酮受體（PR）陰性乳腺癌細(xì)胞表達(dá)的miR-30水平低于其ER/PR陽(yáng)性細(xì)胞。ER/PR陰性乳腺癌細(xì)胞中miR-30過(guò)表達(dá)導(dǎo)致體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移負(fù)荷的減少。在體外，miR-30不影響腫瘤細(xì)胞增殖，但確實(shí)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲。此外，miR-30過(guò)表達(dá)通過(guò)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)破骨細(xì)胞生成和成骨細(xì)胞生成的作用來(lái)恢復(fù)骨穩(wěn)態(tài)。一些與破骨細(xì)胞生成刺激（IL-8，IL-11），成骨細(xì)胞生成抑制（DKK-1），腫瘤細(xì)胞骨模擬（RUNX2，CDH11）和侵襲性（CTGF，ITGA5，ITGB3）相關(guān)的基因被確定為是miR-30抑制的靶點(diǎn)。在這些基因中，沉默ER-/PR-陰性乳腺癌細(xì)胞中的CDH11或ITGA5重現(xiàn)了miR-30對(duì)體內(nèi)骨骼腫瘤負(fù)荷的抑制作用。總體而言，該研究結(jié)果提供了miR-30家族成員采用多種機(jī)制來(lái)阻止乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的證據(jù)，并且可能代表治療干預(yù)的潛在靶標(biāo)。

技術(shù)路線：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖1：人類MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞、MDA-B02成骨細(xì)胞和BC-M1乳腺癌細(xì)胞的miRNA圖譜分析。

（A）miRNA和乳腺癌細(xì)胞系的雙向分層聚類熱圖。miR30家族成員用紅色方框顯示。（B）與MDA-MB-231細(xì)胞相比，對(duì)MDA-B02和BC-M1細(xì)胞中. miR-30-a、-b、-c、-d、-e和.-30-a*、-d*、-e*表達(dá)水平的qRT-PCR分析。（C）與MDA-MB-231細(xì)胞相比，MDA-B02和BC-M1細(xì)胞中Dicer mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR分析。

圖2：乳腺癌細(xì)胞中miR -30s的過(guò)表達(dá)降低了癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物的溶骨性病變和骨腫瘤負(fù)擔(dān)的程度。

（A）腫瘤細(xì)胞接種后第32天，裸鼠中具有溶骨性病變(箭頭)的后肢的代表性X線照片。（B）腫瘤細(xì)胞接種后第32天攜帶MDA-B02-wt、MDA-B02-p.Vec或MDA-B02-p.30a-b-c-d-e腫瘤的動(dòng)物的代表性全身生物發(fā)光成像。（C）Goldner三色法從腫瘤動(dòng)物的脛骨干骺端組織切片。（D）TRAP染色的癌轉(zhuǎn)移骨組織切片。

圖3： miR30s恢復(fù)骨穩(wěn)態(tài)。

（A）用M-CSF+RANKL聯(lián)合模擬轉(zhuǎn)染MDA-B02細(xì)胞(MDA-B02-Ctrl)或MDA-B02細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-30s(MDA-B02-miR-30s)的小鼠骨髓細(xì)胞的體外破骨細(xì)胞分化。（B）上圖：用MDA -B02-CTRL或MDA -B02-miR30S細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行RT-qPCR分析。下圖：MTA-B02-CTRL和MDA -B02-miR30S細(xì)胞的RTQPCR分析。（C）從MDA-B02-Ctrl或MDA-B02-miR-30s細(xì)胞中體外分化成骨MC3T3-E1細(xì)胞。骨礦化結(jié)節(jié)染色采用Von Kossa染色。（D）用MDA B02 CTRL或MDA -B02-miR30S細(xì)胞經(jīng)CM處理的MC3T3-E1細(xì)胞的RT-qPCR分析。（E）在成骨條件下培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的體外分化，然后未經(jīng)處理或用miR-30s模擬物轉(zhuǎn)染。（F）用MDA -B02-CTRL或MDA -B02-miR30S細(xì)胞處理的MC3T3-E1細(xì)胞的RT-qPCR分析。

圖4 ：miR30s減少體內(nèi)乳腺癌的生長(zhǎng)和體外腫瘤細(xì)胞的侵襲。

（A）在雌性裸鼠皮下接種MDA－B02-pmiRVer（對(duì)照）和MDA－B02-pmiR30b-d細(xì)胞。（B,C）CD31和Ki-67免疫染色法分別檢測(cè)接種MDA-B02-pmiRVec和MDA-B02-pmiR-30b-d細(xì)胞小鼠腫瘤組織切片，以測(cè)定腫瘤相關(guān)血管數(shù)量和腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)。（D）MTA-B02-pmiRVer和MDA－B02-pmiR30b-d細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)后作為時(shí)間函數(shù)的計(jì)數(shù)。（E）用miRNA模擬物或干擾物轉(zhuǎn)染MDA-B02細(xì)胞。（F）將MDA-B02-pmiRVec、MDA-B02-pmiR-30b-d、MDA-B02-pmiR-30b-c和MDA-B02-pmiR-30abcde細(xì)胞用涂有基底膜基質(zhì)的多孔膜加載到插入物中， 37℃孵育24h后，取出未侵襲的細(xì)胞，固定并染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。（G）與（F）中相同，用miR-30s的不同基因組序列轉(zhuǎn)導(dǎo)MDA-B02細(xì)胞，并用其對(duì)應(yīng)的antagomiR-30s或scramble antagomiR(陰性對(duì)照)處理。（H）與miR-30模擬轉(zhuǎn)染的MDA-B02和BC-M1細(xì)胞干擾物轉(zhuǎn)染的MDA-B02和BC-M1細(xì)胞（陰性對(duì)照）。

圖5：Cadherin-11（CDH11）是miR-30s抑制的直接靶點(diǎn)。

（A）與親代MDA-MB-231細(xì)胞相比，用miR-30s的不同基因組序列轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDA-B02細(xì)胞中CDH11和α-微管蛋白的蛋白質(zhì)印跡。（B）過(guò)表達(dá)miR-30s HEK-293T細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性。（C）沉默CDH11后CDH11和?-微管蛋白在親本的DAD-B02細(xì)胞和MDA -B02細(xì)胞中的Western印跡（D）MDA-B02和MDA -B02-SH-CDH11細(xì)胞與MC3T3-E1成骨細(xì)胞相互作用。（E）CDA11在MTA-B02中的沉默降低了體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移的負(fù)擔(dān)。

圖6：整合素α5（ITGA5）是miR-30s抑制的直接靶點(diǎn)。

（A）表達(dá)miR-30s模擬物（ITGA5-wtmiR30s，ITGA5-mut-miR-30s）或與psiCheck2-ITGA5報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染的干擾物（ITGA5-wt-Scrbl）的HEK-293T細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性野生型（ITGA5 WT SCRBL，ITGA5-WT-miR30S）或突變（ITGA5-MUT-MI30S）結(jié)合位點(diǎn)。（B）用陰性對(duì)照干擾物(Ctrl)或miR-30s模擬物(miR-30s)轉(zhuǎn)染MDA-B02和BC-M1細(xì)胞后，ITGA5和?-微管蛋白的蛋白印跡。（C）免疫印跡法檢測(cè)ITGA5在模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)(Scrbl)和ITGA5沉默的Hs-578T乳腺癌細(xì)胞(ITGA5沉默)中的表達(dá)。（D）左圖：動(dòng)物在動(dòng)脈內(nèi)接種表達(dá)Hs-578T細(xì)胞的熒光素酶后第7天的全身生物發(fā)光成像，這些細(xì)胞先前被模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)或沉默以表達(dá)ITGA5。右圖：顯示各組動(dòng)物轉(zhuǎn)移率的圖表。（E）通過(guò)多個(gè)miR30調(diào)控網(wǎng)絡(luò)抑制骨轉(zhuǎn)移。MiR-30s抑制與骨擬態(tài)、侵襲和骨破壞相關(guān)的基因，從而抑制骨轉(zhuǎn)移形成。