高分綜述，全面剖析外泌體研究策略

腫瘤分泌的細(xì)胞外囊泡(EVs)是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞在局部和遠(yuǎn)處微環(huán)境中進(jìn)行細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵介質(zhì)。因此，EVs在原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中都起著重要的作用。EVs協(xié)調(diào)了多種系統(tǒng)性病理生理過(guò)程，如凝血、血管滲漏和間質(zhì)受體細(xì)胞的重新編程，以支持轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成和隨后的轉(zhuǎn)移。在臨床上，EVs可能是癌癥進(jìn)展的生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)，特別是用于預(yù)測(cè)和預(yù)防未來(lái)的轉(zhuǎn)移發(fā)展。

1. EVs在促進(jìn)原發(fā)性腫瘤存活和生長(zhǎng)中的作用

EVs在原發(fā)腫瘤形成過(guò)程中促進(jìn)原發(fā)腫瘤的生存和生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞需要與鄰近細(xì)胞及其局部微環(huán)境進(jìn)行積極的溝通。在過(guò)去的十年中，EVs在原發(fā)性腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞間的細(xì)胞通信中扮演著關(guān)鍵的角色(圖1)。EVs被認(rèn)為參與了侵襲過(guò)程中的多個(gè)步驟，可能參與了轉(zhuǎn)移的早期步驟。

圖1. 腫瘤來(lái)源的EVs在原發(fā)性腫瘤微環(huán)境中的作用

2. 原發(fā)性腫瘤亞群可以通過(guò)EVs共享致癌分子

腫瘤分泌的EVs可在原發(fā)腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞間轉(zhuǎn)移致瘤分子。例如，表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體變異體III (EGFRvIII)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌含有EGFRvIII的微泡，并將其轉(zhuǎn)移到同一原發(fā)腫瘤中的EGFRvIII陰性癌細(xì)胞。EGFRvIII通過(guò)受體細(xì)胞的EVs介導(dǎo)攝取，激活絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B (PKB/Akt)信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)化，加速腫瘤生長(zhǎng))。

3. 腫瘤分泌的EVs與鄰近的非腫瘤細(xì)胞交流

腫瘤EVs對(duì)相鄰間質(zhì)細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)有復(fù)雜的作用。含有mRNA、miRNA和血管生成蛋白的膠質(zhì)母細(xì)胞源性微泡被受體細(xì)胞吸收，促進(jìn)原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和內(nèi)皮細(xì)胞增殖。表達(dá)四聚腺苷8的胰腺癌來(lái)源外泌體可以招募蛋白質(zhì)和mRNA，激活內(nèi)皮細(xì)胞中血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。含有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b (TGF-b)的腫瘤來(lái)源外泌體將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)血管形成、腫瘤生長(zhǎng)和局部侵襲。乳腺癌來(lái)源的外泌體也促進(jìn)脂肪組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞中的肌成纖維細(xì)胞表型，導(dǎo)致腫瘤促進(jìn)因子TGF-b、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源因子1 (SDF-1)和C-C motif che表達(dá)增加。相反，腫瘤間質(zhì)分泌的外泌體也會(huì)影響腫瘤的進(jìn)展。乳腺癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞分泌外泌體，這種外泌體已被證明可以促進(jìn)乳腺癌的運(yùn)動(dòng)、侵襲和傳播。

4. 通過(guò)EV介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑促進(jìn)局部腫瘤侵襲

在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞和分子環(huán)境以及細(xì)胞外蛋白和酶的動(dòng)態(tài)變化是由腫瘤來(lái)源的EV引起的。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重塑通常被認(rèn)為促進(jìn)侵襲性腫瘤表型。腫瘤分泌的外泌體攜帶ECM分子纖維連接蛋白，促進(jìn)新生粘附組裝，增加細(xì)胞活力。Sidhu等人(2004)報(bào)道了腫瘤細(xì)胞分泌的EVs將EMMPRIN傳遞給成纖維細(xì)胞，從而引發(fā)MMPs的產(chǎn)生，并導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。VEGF和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF-2)刺激的內(nèi)皮細(xì)胞釋放含有MMPs的EVs，這些MMPs可以啟動(dòng)腫瘤侵襲和無(wú)抑制血管生成所必需的蛋白水解(Taraboletti et al.， 2002)。此外，Hendrix et al.(2010)論證了rab27b介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞釋放HSP90外泌體激活MMP2，導(dǎo)致ECM組分降解。

5. 低氧微環(huán)境與促血管生成腫瘤EVs的關(guān)系

在形成原發(fā)性腫瘤微環(huán)境的因素中，缺氧通過(guò)調(diào)節(jié)間質(zhì)，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖起著中心作用。在缺氧期間，乳腺癌細(xì)胞外泌體釋放增加，這可能是由缺氧誘導(dǎo)因子1-a (HIF1-a)調(diào)控的(King et al.， 2012)。這些觀察結(jié)果表明原發(fā)腫瘤的低氧微環(huán)境可能會(huì)顯著影響外泌體的運(yùn)輸和功能，從而產(chǎn)生局部和全身效應(yīng)，值得進(jìn)一步研究。

6. 腫瘤分泌的ev可能在上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用

腫瘤EVs也可能參與上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。HRAS在Madin-Darby犬腎上皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了外泌體中間充質(zhì)標(biāo)記物(如波形蛋白和MMPs)的包裝，潛在地誘導(dǎo)受體細(xì)胞中的EMT。雖然在功能上沒(méi)有得到驗(yàn)證，但間充質(zhì)細(xì)胞的外泌體與上皮細(xì)胞的EMT誘導(dǎo)之間存在聯(lián)系。同樣，從轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中分離出來(lái)的EVs在亞油酸刺激下誘導(dǎo)上皮細(xì)胞MCF10A細(xì)胞發(fā)生EMT樣過(guò)程。EVs在細(xì)胞極性調(diào)節(jié)和EMT在體內(nèi)啟動(dòng)中的作用需要進(jìn)一步深入研究。

7. 腫瘤EVs通路通過(guò)細(xì)胞外室

腫瘤分泌的EVs進(jìn)行循環(huán)，可從幾乎所有體液中分離，包括血液、唾液和尿液。越來(lái)越多的證據(jù)表明，循環(huán)EVs介導(dǎo)多種細(xì)胞類型在遠(yuǎn)處位點(diǎn)的重新編程，并影響不同的過(guò)程，如凝血、免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)移前小生境(PMN)的建立。

8. 黏性小泡:腫瘤EVs促進(jìn)凝血

一般認(rèn)為轉(zhuǎn)移的發(fā)生與血栓并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，血栓并發(fā)癥是癌癥患者死亡的主要原因(Stein et al.， 2006)。腫瘤部位的凝血和血小板聚集阻止了免疫系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的識(shí)別，促進(jìn)了癌細(xì)胞的遷移和傳播(Sierko和Wojtukiewicz, 2007)。參與凝血的微泡可以來(lái)自血小板、炎癥細(xì)胞和癌細(xì)胞(Rak, 2010)。et al.， 2005)。

9. 腫瘤EVs對(duì)免疫系統(tǒng)有復(fù)雜的影響

早期研究中首次提出了EVs參與免疫調(diào)節(jié)，表明免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜帶MHC I類、MHC II類和T細(xì)胞共刺激分子(Zitvogel等，1998)。從那時(shí)起，EVs在免疫調(diào)節(jié)中的作用就得到了深入的研究。除了來(lái)源于淋巴細(xì)胞的EVs,巨噬細(xì)胞，DCs,非免疫細(xì)胞如上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的EVs，也表達(dá)MHC類分子和腫瘤抗原(如Mart-1 / MelanA),可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。雖然腫瘤EVs似乎大多具有支持腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的免疫抑制作用，但有證據(jù)表明，EVs同時(shí)促進(jìn)了促腫瘤和抗腫瘤作用，這表明腫瘤EVs和免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系是復(fù)雜的，可能在很大程度上依賴于細(xì)胞類型和EV貨物。腫瘤外泌體所施加的免疫調(diào)節(jié)活性可能包括直接向免疫細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，或者將腫瘤抗原轉(zhuǎn)移到DCs，將抗原呈現(xiàn)給T細(xì)胞，以誘導(dǎo)初級(jí)細(xì)胞毒性免疫反應(yīng)。

10. 腫瘤EVs促進(jìn)血管滲漏，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞循環(huán)進(jìn)入遠(yuǎn)端

血管滲漏被認(rèn)為是PMN形成的標(biāo)志(Huang et al. 2009)。腫瘤分泌的外泌體首先通過(guò)向內(nèi)皮細(xì)胞傳遞特定的物質(zhì)來(lái)滲透血管，然后通過(guò)這個(gè)受損的屏障擴(kuò)散，直接與PMNs中的實(shí)質(zhì)細(xì)胞融合，有利于轉(zhuǎn)移定植。分泌含有mir -105的外泌體的轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞會(huì)破壞受體內(nèi)皮細(xì)胞中的緊密連接蛋白ZO1，從而增加血管通透性和轉(zhuǎn)移性侵襲的易感性(Zhou et al.， 2014)。

11. 腫瘤EVs創(chuàng)造了適合腫瘤生長(zhǎng)的新位點(diǎn):PMN

PMN的定義是在遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤的環(huán)境中發(fā)育，適合腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。PMN的概念是由1889年Stephen Paget的早期觀察發(fā)展而來(lái)的，他發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤類型傾向于轉(zhuǎn)移到不同的器官，這表明微環(huán)境在指示轉(zhuǎn)移性侵襲中起作用。

腫瘤分泌的外泌體促進(jìn)了不同類型的細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和不同數(shù)量的骨髓源細(xì)胞)向PMN的募集(Peinado等，2012)。胰腺腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體在肝臟中執(zhí)行PMN形成的逐步進(jìn)展(圖2)(Costa-Silva等，2015)。Jung等人(2009)發(fā)現(xiàn)可溶性因子和來(lái)自CD44變異亞型(CD44v)陽(yáng)性胰腺癌細(xì)胞外泌體的聯(lián)合作用介導(dǎo)了淋巴結(jié)和肺內(nèi)PMN的形成。腫瘤外體miR-494和miR-542p轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)間質(zhì)細(xì)胞和肺成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致cadherin- 17 (Cdh17)下調(diào)和基質(zhì)金屬蛋白酶上調(diào)(Mmp2, Mmp3, Mmp14)。

圖2. 腫瘤來(lái)源的EVs促進(jìn)轉(zhuǎn)移前Niche形成和轉(zhuǎn)移

12. EVs作為生物標(biāo)志物和治療的潛力

EVs作為生物標(biāo)志物的治療潛力已經(jīng)成為監(jiān)測(cè)癌癥進(jìn)展的有前途的生物標(biāo)志物，并成為未來(lái)抗癌治療的新靶點(diǎn)。盡管仍有許多懸而未決的問(wèn)題和方法上的挑戰(zhàn)，但這一快速發(fā)展的領(lǐng)域?qū)⒆罱K對(duì)EVs在臨床環(huán)境中的相關(guān)性提供重要的見(jiàn)解。

13. 未來(lái)的發(fā)展方向

目前，只有很少的標(biāo)記(i.e., TSG101, syntenin, and tetraspanins CD9, CD63, and CD81) 能將外泌體與其他EVs (如微泡或凋亡體)區(qū)分開(kāi)來(lái)(Kowal等，2016)。此外，還沒(méi)有可靠的方法來(lái)描述正常組織分泌的外泌體。迄今為止的大多數(shù)研究都基于EVs的異質(zhì)性種群，這就留下了一個(gè)問(wèn)題，即不同的EV亞群是否在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)作用。這些不同大小的顆粒是否具有不同的腫瘤細(xì)胞起源(如，腫瘤干細(xì)胞)?異質(zhì)性顆粒是否針對(duì)特定的細(xì)胞類型，并通過(guò)不同但互補(bǔ)的機(jī)制促進(jìn)PMN和轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成?

參考文獻(xiàn)：

Becker A, Thakur B K, Weiss J M, et al. Extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis[J]. Cancer cell, 2016, 30(6): 836-848. （IF=22.8）