在4種主要免疫細(xì)胞類型中，細(xì)胞背景對(duì)miR-155介導(dǎo)基因調(diào)控的影響

許多microRNA及其靶mRNA在不同細(xì)胞類型中共表達(dá)。然而，尚不清楚它們是以獨(dú)立于細(xì)胞環(huán)境還是依賴細(xì)胞環(huán)境的方式受到調(diào)節(jié)。近日，來(lái)自美國(guó)的Rudensky和他的團(tuán)隊(duì)在Nat Immunol(IF=21.809)在線發(fā)表了題為“The effect of cellular context on miR-155-mediated gene regulation in four major immune cell types”的文章。探索了miR-155的轉(zhuǎn)錄組范圍靶向和基因調(diào)控，其活化誘導(dǎo)的表達(dá)在先天性和適應(yīng)性免疫中起重要作用。在激活的miR-155充足或者缺陷的巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞和T和B淋巴細(xì)胞中，通過(guò)不同的iCLIP定位miR-155靶標(biāo)，用RNA-seq進(jìn)行mRNA定量，并用的poly(A)-seq進(jìn)行3'非翻譯區(qū)（UTR）的分析，他們鑒定了miR-155差異結(jié)合的許多靶標(biāo)。盡管選擇性切割和多腺苷酸化（ApA）有助于不同的miR-155與一些轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合，但在大多數(shù)情況下，相同的3'-UTR同源異構(gòu)蛋白在細(xì)胞類型中被差異調(diào)節(jié)，因此表明不依賴ApA和細(xì)胞環(huán)境依賴性miR-155介導(dǎo)的基因調(diào)控。他們的研究提供了miR-155調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的綜合圖譜，并為關(guān)鍵免疫細(xì)胞類型中的背景依賴性和背景獨(dú)立的miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控提供了寶貴的資源。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1 mir -155介導(dǎo)的調(diào)控是環(huán)境特異的。

圖1 miR-155介導(dǎo)的Ago結(jié)合發(fā)生在四種免疫細(xì)胞類型的不同位點(diǎn)。

a，四種細(xì)胞類型中miR-155普遍結(jié)合位點(diǎn)與差異結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)例。 iCLIP，RNA-seq和poly(A)-seq文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)化讀長(zhǎng)覆蓋率，野生型（WT）為深色軌跡，miR-155-敲除（KO）為淺色軌跡。含有miR-155-seed的iCLIP峰以灰色矩形突出顯示；星號(hào)表示W(wǎng)T和KO覆蓋范圍之間的顯著差異（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<2.5％）。 b，共表達(dá)基因中miR-155依賴性位點(diǎn)的總結(jié)，包括用不同iCLIP鑒定的3'-UTR，CDS和5'-UTR位點(diǎn)。每行代表miR-155六聚體種子匹配周圍的250bp；顏色表示歸一化WT與miR-155-KO iCLIP覆蓋率比值，并取2為底數(shù)的對(duì)數(shù)。含有miR-155位點(diǎn)的相同基因的RNA表達(dá)在熱圖中并排顯示（WT RNA-seq log10FPKM，通過(guò)行標(biāo)準(zhǔn)化）。根據(jù)四種細(xì)胞類型中的特異性結(jié)合對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行分類，并且通過(guò)對(duì)相應(yīng)基因的RNA-seq FPKM值的層次聚類來(lái)確定每個(gè)類別內(nèi)的順序。 c，共表達(dá)基因中miR-155依賴性iCLIP位點(diǎn)的維恩圖。 d，共表達(dá)基因中miR-155依賴性位點(diǎn)的種子類型組成。 e，共表達(dá)基因中miR-155依賴性位點(diǎn)的PhastCons評(píng)分（對(duì)于小鼠和39種其他胎盤哺乳動(dòng)物之間的多基因組比對(duì)）。顯示了來(lái)自獨(dú)立iCLIP（n = 4），RNA-seq（n = 3）和poly(A)-seq（n = 4）實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的分析。

圖2 miR-155抑制四種免疫細(xì)胞類型中不同的基因集合。

a-d，在樹(shù)突細(xì)胞（a）B細(xì)胞（b），CD4+ T細(xì)胞（c）和巨噬細(xì)胞（d）中，用不同基因集合的累積分布函數(shù)（CDF）顯示miR-155-KO和WT細(xì)胞之間RNA-seq表達(dá)變化的分布?；蚣习ㄋ斜磉_(dá)的基因，具有3'-UTR miR-155六聚體/七聚體-A1 /七聚體-m8 /八聚體-種子匹配的基因和含有具有六聚體種子匹配的3'-UTR miR-155依賴性iCLIP位點(diǎn)的基因（FDR <2.5％）。顯示利用Targetscan 7.0預(yù)測(cè)的最高context++得分的miR-155-靶基因（與通過(guò)不同的iCLIP鑒定的miR-155-靶基因數(shù)目相同）。P值通過(guò)單側(cè)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)測(cè)試確定。數(shù)據(jù)代表獨(dú)立的iCLIP（n = 4）和RNA-seq（n = 3）實(shí)驗(yàn)。

圖3特定背景下的miR-155靶向作用導(dǎo)致不同細(xì)胞類型之間基因調(diào)節(jié)的差異。

a-f，四種免疫細(xì)胞的六個(gè)成對(duì)比較（如圖所示），描繪了含有共同（實(shí)線）和細(xì)胞類型特異性（虛線）3'-UTR miR-155依賴性iCLIP位點(diǎn)的基因的去阻遏，以CDF的形式顯示。具有3'-UTR miR-155-種子匹配的基因?yàn)閰⒖?。每個(gè)成對(duì)比較中僅包括共表達(dá)的基因（WT RNA-seq FPKM> 1且差異<16倍）。在每個(gè)圖中，顯示了來(lái)自單側(cè)KS測(cè)試的兩個(gè)P值。第一次KS測(cè)試對(duì)應(yīng)于在該細(xì)胞類型中鑒定的所有miR-155靶基因與僅在其他細(xì)胞中靶向的基因之間的比較，第二次對(duì)應(yīng)于共同靶基因和對(duì)該細(xì)胞類型特異的靶基因之間的比較。顯示了四個(gè)獨(dú)立的iCLIP和三個(gè)獨(dú)立的RNA-seq實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 DC，樹(shù)突狀細(xì)胞; mac，巨噬細(xì)胞。

圖4 細(xì)胞類型依賴性miR-155介導(dǎo)抑制的驗(yàn)證。

報(bào)告基因攜帶了表現(xiàn)出環(huán)境特異靶向性基因的3'-UTR，在B細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中表達(dá)。顯示了Hif1a和Jarid2（優(yōu)先在B細(xì)胞中被抑制），Actr10和Terf1（B細(xì)胞特異性靶標(biāo)）和Tbca，Uqcrfs1和Zfp277（樹(shù)突細(xì)胞特異性靶標(biāo)）的結(jié)果。折疊抑制被定義為3'-UTR報(bào)告基因的突變體和野生型的標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性的比率。箱形圖顯示匯總統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，包括中位數(shù)，第25和75百分位數(shù)，1.5倍四分位數(shù)間距（IQR）和異常值。誤差棒，s.e。 來(lái)自至少三個(gè)生物學(xué)上獨(dú)立的樣品（對(duì)于Hif1a，Jarid2，Tbca和Uqcrfs1，n = 3;對(duì)于Actr10，Terf1和Zfp277，n = 4）; P值通過(guò)雙側(cè)t檢驗(yàn)確定。 * P <0.05; ** P <0.01

2 內(nèi)源性RNA競(jìng)爭(zhēng)不太可能影響miR-155靶向，而ApA對(duì)細(xì)胞類型特異性miR-155靶向的貢獻(xiàn)有限。

圖5 Poly(A)-seq捕獲CD4+ T細(xì)胞活化期間3'-uTR-同源異構(gòu)蛋白使用的變化。

a，在CD4+ T細(xì)胞活化期間，同源異構(gòu)蛋白使用中具有顯著（FDR <5％）變化的的兩個(gè)3'-UTR實(shí)例。軌跡表示激活后0小時(shí)，24小時(shí)和48小時(shí)的歸一化poly(A)-seq讀長(zhǎng)覆蓋率。b，在CD4 + T細(xì)胞活化后48小時(shí)，具有兩種主要同源異構(gòu)蛋白的3'-UTR的3'-UTR-同源異構(gòu)蛋白使用的變化。突出顯示的基因在3'-UTR使用中顯示出顯著的（FDR <5％）變化。c，如在b中，但突出顯示了含有miR-155靶位點(diǎn)的雙同源異構(gòu)蛋白的3'-UTR。突出顯示了含有近端（實(shí)心）和遠(yuǎn)端（空心）miR-155-靶位點(diǎn)的3'-UTR。顯示了三個(gè)獨(dú)立的poly(A)-seq實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

圖6 替代聚腺苷酸在miR-155調(diào)控細(xì)胞-環(huán)境依賴性基因表達(dá)中的作用。

a. multi-isoform 3′UTR在所有四個(gè)細(xì)胞類型熱圖變化。b、3′UTR包含mir - 155細(xì)胞類型特異的ApA目標(biāo)和顯示差異。c、iCLIP、RNA-seq和poly(A)-seq在Rbm33的樹(shù)突狀細(xì)胞和CD4 + T細(xì)胞中的讀取-覆蓋。d, Venn圖顯示了樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞中共享和細(xì)胞特異性mir -155靶基因的數(shù)量，這些基因在去除具有細(xì)胞類型特異性ApA差異的基因之前和之后變化。

圖7 其他miRNA的iCLIP靶位點(diǎn)表達(dá)誘導(dǎo)顯著的基因抑制。

a-c，具有miR-142a KO的B細(xì)胞（a）和樹(shù)突細(xì)胞（b）以及具有miR-27a過(guò)表達(dá)（c）的CD4 + T細(xì)胞中的mRNA表達(dá)變化，顯示為不同基因組的CDF。