有了RNA-protein 相互作用的研究方法，再也不愁高分的SCI文章了！

      熱門研究的非編碼RNA，包含LncRNAs、snoRNAs和mRNA UTR，其許多功能是與RNA結(jié)合蛋白(RBPs)直接相互作用實(shí)現(xiàn)的。最近研究發(fā)現(xiàn)數(shù)百種新RBPs的RNA結(jié)合域尚不清楚，于是強(qiáng)調(diào)RNA蛋白復(fù)合物的復(fù)雜性和多樣性，進(jìn)而最新研究成果擴(kuò)展了RNA-protein 相互作用的兩大類方法：一類方法是以RNA為中心，研究與感興趣的RNA結(jié)合的protein；另一類方法是以蛋白質(zhì)為中心，研究與感興趣的protein結(jié)合的RNAs。由于每種方法都有其優(yōu)勢和局限，選擇最佳方法來處理生物學(xué)問題變得非常重要。(Review,Methods to study RNA-protein interactions,IF=28.464)
一、以RNA為中心的方法：發(fā)現(xiàn)與感興趣的RNA結(jié)合的RBPs
1.以RNA為中心的方法示意圖

以RNA為中心的方法又分體內(nèi)方法和體外方法。
體外方法：
      方法a（1）是用于pull down 實(shí)驗(yàn)的RNA 5 '或3 ' RNA生物素化。末端生物素化RNA與streptavidin beads（鏈霉親和素珠）結(jié)合，然后加入細(xì)胞提取物孵育后洗滌。此方法不需要洗脫RNA，向beads加入SDS，煮沸，用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
      方法a（2）是感興趣的RNA加適體標(biāo)簽，例如，S1適體標(biāo)簽與streptavidin beads結(jié)合，生物素可以競爭性地結(jié)合streptavidin ，以洗脫標(biāo)記有S1適體的RNA。已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，Cys4 核糖核酸內(nèi)切酶可以結(jié)合Cys4 hairpin loop，用imidazole（咪唑）將核酸酶從發(fā)夾環(huán)上分離，釋放結(jié)合RNA的RBPs。優(yōu)缺點(diǎn)：降低了非特異性的結(jié)果。
      方法a（3）標(biāo)記Cy5染料的體外轉(zhuǎn)錄（IVT ）RNA雜交到約9400個(gè)重組人蛋白(Human ProtoArray)的蛋白芯片。通過熒光檢測結(jié)合Cy5 RNA的蛋白質(zhì)。優(yōu)缺點(diǎn)：Human ProtoArray方法不需要細(xì)胞提取物，有助于發(fā)現(xiàn)RNA-protein 相互作用的一種研究方法。然而，這類方法限制于斑點(diǎn)蛋白的折疊結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾以及濃度的改變。
體內(nèi)方法：
      甲醛是一種小的雙功能交聯(lián)劑，易滲透細(xì)胞并在2個(gè)單位內(nèi)交聯(lián)大分子，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物交聯(lián)，這種交聯(lián)是可逆的。UV light 交聯(lián)是一種零距離交聯(lián)且不可逆。與甲醛交聯(lián)劑相比，UV light 不交聯(lián)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，特異性強(qiáng)，但效率較低。
      方法b（1）是通過蛋白-RNA交聯(lián)進(jìn)而鑒定體內(nèi)的相互作用。具體內(nèi)容是在變性條件下去除非共價(jià)相互作用來純化RNA，生物素化寡核苷酸探針與感興趣的RNA雜交， RNA和交聯(lián)蛋白被純化與鑒定。優(yōu)缺點(diǎn)：效率低，細(xì)胞用量多。
      方法b（2）RNA-蛋白質(zhì)相互作用檢測法簡稱RaPID (LN-HA-Bira)，BoxB RNA莖環(huán)側(cè)面結(jié)合感興趣RNA，在含有生物素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，BoxB位點(diǎn)結(jié)合融合蛋白（λ-N ），融合蛋白引起與感興趣RNA結(jié)合的蛋白生物素化，最后用streptavidin beads捕獲生物素化的蛋白質(zhì)。

二、以蛋白為中心的方法：發(fā)現(xiàn)與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的RNAs
1.蛋白質(zhì)純化的方法

      紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測序(CLIP-seq)原理
  基于RNA分子與RNA結(jié)合蛋白在紫外照射下發(fā)生耦聯(lián)，以RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀之后，回收其中的RNA片段，經(jīng)添加接頭、RT-PCR等步驟，對這些分子進(jìn)行高通量測序，再經(jīng)生物信息學(xué)的分析和處理、總結(jié)，挖掘出其特定規(guī)律，在體內(nèi)與眾多 RNA 靶標(biāo)的結(jié)合模式，并揭示其在一些重要生物學(xué)過程中的功能，是一項(xiàng)在全基因組水平揭示 RNA分子與RBP相互作用的革命性技術(shù)。能夠確定RBP與RNA直接的相互作用和精確的結(jié)合位點(diǎn)。
  CLIP-seq 的應(yīng)用范圍：
  （1）繪制全基因組范圍的RNA和RBP相互作用圖譜，解析“Argonaute（Ago）—miRNA—mRNA”三者的相互作用；
  （2）RBP與miRNA、lncRNA等非編碼RNA的作用網(wǎng)絡(luò)與功能的發(fā)現(xiàn)；
  （3）與 RIP-seq 相比，可以鑒定RBP和RNA之間的直接相互作用，確定 RBP 與miRNA、lncRNA 等非編碼 RNA 的精確結(jié)合位點(diǎn)。
  上圖展示了從免疫沉淀到PCR，該圖顯示CLIP-seq的一些重要步驟。例如：XL，UV交聯(lián)；IP，免疫反應(yīng)；磷酸酶，3’端去磷酸化；激酶，5’端磷酸化；RT，逆轉(zhuǎn)錄；L3，RNA或DNA 3’端適體連接；L5，5’端適體連接；PK提取，從硝基纖維素膜中提取蛋白酶K；Ppt/柱，乙醇沉淀或柱分離核酸；TBE、Tris-B酸鹽-EDTA；SA、抗生物素蛋白。
2.不需要蛋白質(zhì)純化的方法
  在不純化RBP的情況下識(shí)別RBP的靶RNA的方法是相對較新的，目前主要是對RNA進(jìn)行兩種不同化學(xué)修飾。第一種是TRIBE，感興趣的蛋白質(zhì)融合到ADAR酶，在ADAR使附近的腺嘌呤脫氨后，通過測序鑒定脫氨堿基。第二種是RNA標(biāo)記法，poly(U)多聚酶與感興趣的RBP融合后，添加poly(U)尾到結(jié)合的RNA。RNA 3’末端序列識(shí)別poly(U)尾；在特定亞細(xì)胞區(qū)過氧化物酶標(biāo)記RBP，用于識(shí)別結(jié)合的RNA，這種方法還沒有被用來鑒定靶RNA。酶修飾RNA的方法是可行的，以后會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的酶修飾RNA。
  我們希望更多的技術(shù)在這一領(lǐng)域快速發(fā)展，多種差異的化學(xué)標(biāo)記分離RBP對于RBP純化組合調(diào)控和化學(xué)修飾組合研究，以此研究RBP-RNA相互作用的位置。