單細(xì)胞測序首次揭示老年Neurogenic Niche的T細(xì)胞浸潤

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)展迅速，在各個研究領(lǐng)域尤其是在發(fā)育、免疫和腫瘤方面的應(yīng)用廣泛，相關(guān)高水平文章也層出不窮。這里小編給大家分享一篇最近發(fā)表在Nature上的一篇關(guān)于在神經(jīng)源龕(neurogenic niche)在衰老過程中運(yùn)用單細(xì)胞測序技術(shù)檢測其復(fù)雜細(xì)胞組成變化的文章(DOI: 10.1038/s41586-019-1362-5)。

在衰老過程中，各類組織的功能衰退是眾所周知的事情。但這個過程中組織內(nèi)的細(xì)胞組成變化卻鮮為人知。作者提出這一問題后，選取了腦室下區(qū)（subventricular zone, SVZ） neurogenic niche部位為研究對象。這里是神經(jīng)形成的地方，而且細(xì)胞類型眾多，在衰老過程中功能逐漸衰退。下面是文章的技術(shù)路線。

                                                                       圖1 單細(xì)胞測序揭示老年neurogenic niches中細(xì)胞組成變化并鑒定增加的T細(xì)胞類群
 作者首先對3只3個月和3只28-29個月的小鼠該部位進(jìn)行灌流后取材，流式分選去除破碎細(xì)胞后使用10X Genomics Chromium platform進(jìn)行單細(xì)胞測序。他們得到了14,685個高質(zhì)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過t-SNE分析，兩組樣品中一共發(fā)現(xiàn)了11種不同的細(xì)胞類型（星形膠質(zhì)細(xì)胞、靜息神經(jīng)干細(xì)胞、活化神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)元、少突細(xì)胞祖細(xì)胞、少突細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞）。（圖1 a）通過兩組樣品間比較，作者發(fā)現(xiàn)活化神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞類群數(shù)量在老年組中顯著減少；這與之前報道的結(jié)果一致。同時，他們發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞類群基本只在老年組小鼠中出現(xiàn)（圖1 b）。接下來作者對這些增加的T細(xì)胞進(jìn)行深入研究。
作者首先通過CD3的免疫熒光染色檢測了T細(xì)胞在該組織中的定位。通過與CD31（內(nèi)皮細(xì)胞）、SOX2（神經(jīng)干細(xì)胞）、Ki-67（增殖細(xì)胞）共染發(fā)現(xiàn)這些T細(xì)胞沒有分布在血管中，而是在腦實(shí)質(zhì)中，并且更靠近神經(jīng)干細(xì)胞（圖1 e）。那么這些T細(xì)胞的分子標(biāo)志是怎樣的呢？流式和測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞屬于CD3⁺CD8⁺CD4^? T細(xì)胞（圖1 j），而且也表達(dá)CD44、Itgal、CD69和IFN-γ等（圖1 i）。為了驗(yàn)證在人和小鼠中是否有同樣的現(xiàn)象，作者在人腦切片樣品中通過免疫組化檢測了CD3和CD8的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)老年人腦中對應(yīng)的T細(xì)胞也顯著多于年輕人（圖1 l m）。

                                                                                                            圖2 單細(xì)胞測序和巢式PCR鑒定血液和腦中T細(xì)胞的克隆差異
  那么腦中出現(xiàn)的T細(xì)胞來源于哪呢？是否是因衰老過程中血腦屏障功能減弱而從血液中被動擴(kuò)散而來呢？作者對老年小鼠血液中的CD8⁺T細(xì)胞和neurogenic niches中的T細(xì)胞進(jìn)行了Smart-seq V4單細(xì)胞測序和TCR Nested PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一老年小鼠血液和腦中的CD8⁺T細(xì)胞類群差異很大（圖2 a），例如neurogenic niches中的T細(xì)胞高表達(dá)IFN-γ和PD-1（圖2 b）。而TCR-β的序列分析顯示它們多數(shù)經(jīng)克隆擴(kuò)增而來，但血液和neurogenic niches中T細(xì)胞克隆并不相同（圖2 f）。因此作者認(rèn)為neurogenic niches中的T細(xì)胞并不是血液中的T細(xì)胞簡單的被動擴(kuò)散而來，有可能是識別了老年小鼠腦中的某種抗原。

                                                                                                             圖3 Neurogenic niche有干擾素信號通路激活
      接下來，作者進(jìn)一步研究了這個T細(xì)胞類群對neurogenic niche的影響。有報道檢測了干擾素對大腦發(fā)育和neurogenic niche的影響，但仍沒有結(jié)果。作者根據(jù)單細(xì)胞測序結(jié)果找出表達(dá)IFN-γ受體的細(xì)胞類群（星形膠質(zhì)細(xì)胞、靜息神經(jīng)干細(xì)胞、活化神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)了在這些細(xì)胞類群中IFN-γ通路相關(guān)基因的表達(dá)量更高（圖3 a），而且在老年組中也顯著高于年輕組（圖3 f g h i）。通過數(shù)據(jù)分析并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，作者找到BST2作為IFN-γ反應(yīng)的分子標(biāo)志。通過分選BST2陽性和陰性的細(xì)胞分別進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)BST2陽性的細(xì)胞富集的信號通路主要是干擾素反應(yīng)通路，而BST2陰性的細(xì)胞富集通路主要與細(xì)胞周期相關(guān)（圖4 b）。接下來，作者通過T細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的共培養(yǎng)驗(yàn)證了這一調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞處理后的神經(jīng)干細(xì)胞BST2表達(dá)量顯著上升，增殖能力也顯著下降（圖4 g h i）。

                                                                                                         圖4 T細(xì)胞通過IFN-γ信號通路抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖
      這是一篇通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類群并深入研究其功能的代表性文章，值得大家學(xué)習(xí)參考。其中細(xì)胞類群檢測采用了10X Genomics Chromium platform的方法，屬于mRNA 3’端測序，商業(yè)化體系已非常完善；而另一種Smart-seq V4單細(xì)胞測序則是針對全長mRNA。