揭秘融合基因生成的circRNA

最新證據(jù)表明，融合基因不僅編碼融合蛋白，還能夠產(chǎn)生circRNA(通過線性RNA的反向剪接產(chǎn)生的一種共價鍵結(jié)合的RNA分子)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本次主要介紹融合基因SLC34A2-ROS1，其編碼融合蛋白以激活下游信號通路，如JAK/STAT、PI3K/Akt和RAS/Raf通路，并促進細胞增殖和存活。然而，SLC34A2-ROS 1基因在腫瘤發(fā)生過程中的潛在機制尚不清楚。
7月份，Ke Wu等人發(fā)表一篇 “Circular RNA F-circSR derived from SLC34A2-ROS1 fusion gene promotes cell migration in non-small cell lung cancer ”的SCI文章，由于SLC34A2-ROS 1基因是否產(chǎn)生circRNA仍未知，此文章研究人員不僅鑒定SLC34A2-ROS 1基因產(chǎn)生的circRNA F-cycSRs，還研究 F-cycSRs的潛在機制。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
一、在NSCLC細胞中鑒定circRNA F-circSR

 SCLC細胞株HCC 78具有兩種SLC34A2-ROS1融合基因，即兩種長、短轉(zhuǎn)錄本(SLC34A2外顯子4分別與ROS 1外顯子32和34融合)(圖A-B)。瓊脂糖凝膠電泳和RT-PCR產(chǎn)物的Sanger sequencing證實兩種SLC34A2-ROS 1 mRNA，與GenBank中的EU236946.1和EU236947.1參考序列一致；檢測出SLC34A2-ROS 1和F-SrcSRs融合位點（箭頭指示方向）（圖C-D），在HCC 78細胞中qPCR結(jié)果顯示F-cyclcSR 1表達水平明顯高于F-cyclcSR 2（附件）。
二、F-circSR促進NSCLC細胞遷移

構(gòu)建pCRE5-F-CircSR質(zhì)粒，其圖譜如上圖所示（圖A）。瓊脂糖凝膠電泳和Sanger sequencing驗證HEK293Tc-F-cycSR與HEK293Tc-Ctrl中 F-cycSR正確環(huán)化（圖B）。由于H1299和A549細胞不表達SLC34A2-ROS1融合蛋白，選擇這兩種細胞系為構(gòu)建過表達F-cycSR的細胞株，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳驗證A549-F-cycSR和H1299-F-cycSR細胞穩(wěn)定過表達F-cycSR（圖C）。Transwell遷移實驗表明，F(xiàn)-cycSR均顯著促進細胞遷移（圖D）。然而，MTT和colony formation實驗表明，F(xiàn)-cycSR對細胞增殖影響不大。Wound healing assay 檢測F-cycSR均顯著促進細胞遷移（圖E-F）。根據(jù)circRNA反向剪接連接處設(shè)計siRNAs，Transwell遷移實驗表明，敲減F-cycSR顯著降低A549-F-cycSR和H1299-F-cycSR細胞的遷移能力。由此可見，F(xiàn)-crcSR具有促進NSCLC細胞遷移的作用。
三、側(cè)翼內(nèi)含子的互補序列對F-CircSR生物發(fā)生起著重要的作用。

     
  cycSR由多個外顯子組成，circRNA生物發(fā)生依賴于順式作用元件，其位于循環(huán)外顯子的側(cè)翼內(nèi)含子，通常含有反向互補序列。生物信息學分析表明，cycSR的側(cè)翼內(nèi)含子具有反向互補序列(命名為CS1和CS2)，由于cycSR1匹配序列較長，cycSR1中的CS1-CS2互補性比CircSR 2強（圖A）。此文章研究人員分別將cycSR1與CircSR 2的CS1和CS2序列克隆到含分裂的外顯子GFP報告系統(tǒng)，，除非插入的CS1和CS2序列，反向剪接產(chǎn)生circRNA，否則不表達GFP蛋白。此外，研究人員構(gòu)建了剪接位點突變(從“AG”到“TT”，M1質(zhì)粒)的質(zhì)粒與下游互補序列CS2缺失的質(zhì)粒(M2質(zhì)粒)(圖B)。GFP報告系統(tǒng)插入CIRCR正常的CS1和CS2序列可以驅(qū)動CircRNA形成來表達GFP蛋白，免疫熒光實驗證明了cycSR1的CS1和CS2序列比CircSR 2的活性更強，生物信息學數(shù)據(jù)分析出CircSR 1中CS1和CS2的互補性更強，兩者的結(jié)果是一致的。因此，配對較長的序列促進circRNA的形成，然而，破壞剪接位點或cycSR的互補序列，阻斷了circRNA的形成，因此GFP不表達(圖C)。Western blotting和流式細胞儀實驗進一步證實了上述結(jié)論(圖D-E)。因此，具有剪接位點的側(cè)翼互補序列對cycSR的形成具有重要意義。通過激活ROS 1信號SLC34A2-ROS 1融合基因編碼蛋白參與腫瘤的發(fā)生。上述結(jié)果表明， SLC34A2-ROS1可以產(chǎn)生circRNA發(fā)揮其致癌作用。此外，此文章也進行了生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)circRNA具有miR-150-5p, miR-194-3p and miR-515- 5p 的結(jié)合位點，據(jù)報道這些miRNA調(diào)節(jié)細胞遷移能力。因此F-CircSR可以作為miRNA海綿發(fā)揮其功能。
結(jié)論：                                              
      此研究鑒定了在NSCLC細胞中SLC34A2-ROS1融合基因產(chǎn)生的兩個新的CircSR1(命名為F-CIRCR1和F-CIRCR2)，F(xiàn)-CIRCR1的表達高于F-CircSR2，側(cè)翼互補序列和典型的剪接位點促進F-CIRCR1和F-CIRCR2的形成。此外，F(xiàn)-CircSR均促進細胞遷移。因此，此文獻不僅擴大了對腫瘤生物學中染色體易位的認識，也提供了潛在的診斷和治療生物標志物。