揭秘融合基因生成的circRNA

最新證據(jù)表明，融合基因不僅編碼融合蛋白，還能夠產(chǎn)生circRNA(通過(guò)線性RNA的反向剪接產(chǎn)生的一種共價(jià)鍵結(jié)合的RNA分子)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本次主要介紹融合基因SLC34A2-ROS1，其編碼融合蛋白以激活下游信號(hào)通路，如JAK/STAT、PI3K/Akt和RAS/Raf通路，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。然而，SLC34A2-ROS 1基因在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的潛在機(jī)制尚不清楚。
7月份，Ke Wu等人發(fā)表一篇 “Circular RNA F-circSR derived from SLC34A2-ROS1 fusion gene promotes cell migration in non-small cell lung cancer ”的SCI文章，由于SLC34A2-ROS 1基因是否產(chǎn)生circRNA仍未知，此文章研究人員不僅鑒定SLC34A2-ROS 1基因產(chǎn)生的circRNA F-cycSRs，還研究 F-cycSRs的潛在機(jī)制。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
一、在NSCLC細(xì)胞中鑒定circRNA F-circSR

 SCLC細(xì)胞株HCC 78具有兩種SLC34A2-ROS1融合基因，即兩種長(zhǎng)、短轉(zhuǎn)錄本(SLC34A2外顯子4分別與ROS 1外顯子32和34融合)(圖A-B)。瓊脂糖凝膠電泳和RT-PCR產(chǎn)物的Sanger sequencing證實(shí)兩種SLC34A2-ROS 1 mRNA，與GenBank中的EU236946.1和EU236947.1參考序列一致；檢測(cè)出SLC34A2-ROS 1和F-SrcSRs融合位點(diǎn)（箭頭指示方向）（圖C-D），在HCC 78細(xì)胞中qPCR結(jié)果顯示F-cyclcSR 1表達(dá)水平明顯高于F-cyclcSR 2（附件）。
二、F-circSR促進(jìn)NSCLC細(xì)胞遷移

構(gòu)建pCRE5-F-CircSR質(zhì)粒，其圖譜如上圖所示（圖A）。瓊脂糖凝膠電泳和Sanger sequencing驗(yàn)證HEK293Tc-F-cycSR與HEK293Tc-Ctrl中 F-cycSR正確環(huán)化（圖B）。由于H1299和A549細(xì)胞不表達(dá)SLC34A2-ROS1融合蛋白，選擇這兩種細(xì)胞系為構(gòu)建過(guò)表達(dá)F-cycSR的細(xì)胞株，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄后RT-PCR，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證A549-F-cycSR和H1299-F-cycSR細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)表達(dá)F-cycSR（圖C）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)-cycSR均顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移（圖D）。然而，MTT和colony formation實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)-cycSR對(duì)細(xì)胞增殖影響不大。Wound healing assay 檢測(cè)F-cycSR均顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移（圖E-F）。根據(jù)circRNA反向剪接連接處設(shè)計(jì)siRNAs，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明，敲減F-cycSR顯著降低A549-F-cycSR和H1299-F-cycSR細(xì)胞的遷移能力。由此可見(jiàn)，F(xiàn)-crcSR具有促進(jìn)NSCLC細(xì)胞遷移的作用。
三、側(cè)翼內(nèi)含子的互補(bǔ)序列對(duì)F-CircSR生物發(fā)生起著重要的作用。

     
  cycSR由多個(gè)外顯子組成，circRNA生物發(fā)生依賴于順式作用元件，其位于循環(huán)外顯子的側(cè)翼內(nèi)含子，通常含有反向互補(bǔ)序列。生物信息學(xué)分析表明，cycSR的側(cè)翼內(nèi)含子具有反向互補(bǔ)序列(命名為CS1和CS2)，由于cycSR1匹配序列較長(zhǎng)，cycSR1中的CS1-CS2互補(bǔ)性比CircSR 2強(qiáng)（圖A）。此文章研究人員分別將cycSR1與CircSR 2的CS1和CS2序列克隆到含分裂的外顯子GFP報(bào)告系統(tǒng)，，除非插入的CS1和CS2序列，反向剪接產(chǎn)生circRNA，否則不表達(dá)GFP蛋白。此外，研究人員構(gòu)建了剪接位點(diǎn)突變(從“AG”到“TT”，M1質(zhì)粒)的質(zhì)粒與下游互補(bǔ)序列CS2缺失的質(zhì)粒(M2質(zhì)粒)(圖B)。GFP報(bào)告系統(tǒng)插入CIRCR正常的CS1和CS2序列可以驅(qū)動(dòng)CircRNA形成來(lái)表達(dá)GFP蛋白，免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了cycSR1的CS1和CS2序列比CircSR 2的活性更強(qiáng)，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析出CircSR 1中CS1和CS2的互補(bǔ)性更強(qiáng)，兩者的結(jié)果是一致的。因此，配對(duì)較長(zhǎng)的序列促進(jìn)circRNA的形成，然而，破壞剪接位點(diǎn)或cycSR的互補(bǔ)序列，阻斷了circRNA的形成，因此GFP不表達(dá)(圖C)。Western blotting和流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論(圖D-E)。因此，具有剪接位點(diǎn)的側(cè)翼互補(bǔ)序列對(duì)cycSR的形成具有重要意義。通過(guò)激活ROS 1信號(hào)SLC34A2-ROS 1融合基因編碼蛋白參與腫瘤的發(fā)生。上述結(jié)果表明， SLC34A2-ROS1可以產(chǎn)生circRNA發(fā)揮其致癌作用。此外，此文章也進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)circRNA具有miR-150-5p, miR-194-3p and miR-515- 5p 的結(jié)合位點(diǎn)，據(jù)報(bào)道這些miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移能力。因此F-CircSR可以作為miRNA海綿發(fā)揮其功能。
結(jié)論：                                              
      此研究鑒定了在NSCLC細(xì)胞中SLC34A2-ROS1融合基因產(chǎn)生的兩個(gè)新的CircSR1(命名為F-CIRCR1和F-CIRCR2)，F(xiàn)-CIRCR1的表達(dá)高于F-CircSR2，側(cè)翼互補(bǔ)序列和典型的剪接位點(diǎn)促進(jìn)F-CIRCR1和F-CIRCR2的形成。此外，F(xiàn)-CircSR均促進(jìn)細(xì)胞遷移。因此，此文獻(xiàn)不僅擴(kuò)大了對(duì)腫瘤生物學(xué)中染色體易位的認(rèn)識(shí)，也提供了潛在的診斷和治療生物標(biāo)志物。