肥胖病研究新火花：m6A甲基化可調控自噬和脂肪形成

   肥胖，一類由脂肪細胞的體積和數(shù)量增加所引起的脂肪組織的異?；蜻^度積累的疾病，已然成為人們關注的焦點，提高對于脂肪生成分子機制的理解具有重要的科學意義。研究人員已提出許多調節(jié)脂肪細胞分化的機制，包括細胞外信號，轉錄級聯(lián)和表觀基因修飾等。近日，這篇文章提出了肥胖研究的新奇思路，甲基化和自噬之間能碰撞出什么火花呢，我們來一睹為快吧。

文章思路：

1.FTO促進自噬并進一步增強脂肪形成
   探討FTO在自噬中的作用：3T3-L1細胞中FTO敲低顯著降低LC3-II：I比值和增加SQSTM1水平，表明沒有穩(wěn)態(tài)自噬體形成。相反，過度表達HA標記的FTO顯著提高LC3-II：I比值和減弱SQSTM1表達，表明FTO與自噬之間存在正相關關系。FTO的沉默減少自噬體的數(shù)量， 減輕自噬的激活。為確定自噬是否受FTO過表達影響， 3-MA或巴弗洛霉素A1處理實驗進一步證實FTO促進自噬的激活。
   檢測FTO是否通過自噬影響脂肪形成： 3-MA和Baf A1處理可以逆轉FTO過表達細胞中增強的自噬、脂肪生成和甘油三酯的積累。脂肪細胞標記基因，包括Pparg、Fabp4和Cebpa在FTO過表達細胞中顯著升高，3-MA或Baf A1處理可以下調到正常水平。這些結果表明FTO通過促進自噬增強脂肪細胞分化。

2. 敲低FTO可降低ATG5和ATG5的表達，但沒有降低ULK1的表達
   鑒定FTO在自噬中的潛在靶基因：檢測FTO敲低后自噬相關基因的表達，Atg5和Atg7水平均減弱，而ULK1等自噬相關蛋白，如ATG12和ATG16L1，沒有顯著改變。檢查脂肪細胞分化過程中ATG5和ATG7的表達譜，發(fā)現(xiàn)它們都在早期有所增加，之后都減少，這與FTO的表達模式相似。這些表明FTO的靶基因可能是Atg5和Atg7，而不是Ulk1。
   檢測ATG5和ATG7對自噬和脂肪生成的影響：3T3-L1脂肪前體細胞敲低Atg5和Atg7， LC3II:I比值降低， FTO蛋白表達沒變化。FTO，ATG5和ATG7獨自敲低都會抑制脂肪生成和甘油三酯積累，脂肪細胞標記基因水平下調。

3.FTO靶向 ATG5和ATG7并影響自噬和脂肪形成
   FTO過表達增加Atg5和Atg7的mRNA水平，沉默ATG5可逆轉FTO過表達3T3-L1細胞中上調的LC3-II：I比例， ATG7效果一樣，表明FTO通過調節(jié)ATG5和ATG7的表達影響自噬。前人研究發(fā)現(xiàn)ATG5和ATG7敲低抑制自噬并減少CEBPB水平，抑制PPARG和CEBPA表達損害脂肪形成分化，提示FTO通過Atg5和Atg7-Cebpb信號調節(jié)脂肪生成。FTO強表達促進CEBPB蛋白水平，而ATG5和ATG7的敲低逆轉CEBPB的表達（圖3D）。ATG5和ATG7的敲低恢復了FTO過表達3T3-L1細胞的脂肪生成 和甘油三酯積累， FTO過表達細胞中Pparg，F(xiàn)abp4和Cebpa的mRNA和蛋白水平也被逆轉。FTO通過調節(jié)Atg5和Atg7-Cebpb信號軸促進脂肪生成。

4.FTO以 m6A依賴方式調節(jié)ATG5和ATG7的表達
   構建野生型（FTO-WT）和突變的FTOR96Q（FTO-MUT）質粒，來確定FTO的去甲基酶活性是否必須。LC-MS / MS確認FTO-WT或FTO-MUT的異位表達對細胞m6A水平的影響。異位表達FTO-WT，但不是FTO-MUT，顯著增加LC3-II：I表達，LC3斑點顯著增強,自噬體的數(shù)量提高。這些結果證明FTO去甲基化的活性是前脂肪細胞中自噬所必需的。
   調查FTO通過RNA去甲基化影響ATG5和ATG7表達，異位表達FTO-WT增加ATG5和ATG7的蛋白質和mRNA水平，而ULK1蛋白豐度沒有變化。在Atg5和Atg7的3'UTR處發(fā)現(xiàn)m6A修飾。發(fā)現(xiàn)FTO的敲除增加3T3-L1細胞的m6A水平。基因特異性甲基化RNA免疫沉淀-qPCR（MeRIP-qPCR）表明FTO敲低顯著增加Atg5和Atg7 mRNA轉錄物的m6A水平，但不對Ulk1有影響。評估靶mRNA進行m6A修飾對于FTO介導的基因調控是否必要，3T3-L1細胞中進行雙熒光素酶報告和誘變實驗。強表達FTO-WT，但不是FTO-MUT，大大促進含有Atg5和Atg7的3'UTR片段的單個報告結構的熒光素酶活性，當m6A位置發(fā)生突變時，這種增加被消除，證明FTO通過m6A依賴機制調節(jié)ATG5和ATG7的表達。油紅O染色分析顯示FTO-WT促進脂肪細胞分化和甘油三酯積累，驗證去甲基化脂肪形成需要FTO的活性。這些結果說明FTO靶向Atg5和Atg7轉錄物并以m6A依賴的方式介導他們的表達，進一步調節(jié)自噬和脂肪生成。

5.YTHDF2通過m6A依賴機制介導ATG5和ATG7的mRNA穩(wěn)定性和表達
   m6A甲基化影響mRNA穩(wěn)定性和翻譯，YTHDF2選擇性識別m6A修飾的mRNA并使其不穩(wěn)定，促進目標mRNA的翻譯。進一步解釋FTO靶基因的m6A甲基化和蛋白質豐度之間的負相關，首先研究ATG5和ATG7表達是否受YTHDF2或YTHDF1的影響，YTHDF2過表達顯著降低ATG5和ATG7蛋白水平，而ULK1和ATG12無變化，強表達YTHDF1不影響ATG5和ATG7的表達。
   檢測在Atg5和Atg7 mRNAs的m6A修飾對YTHDF2介導的基因調控是是否必需的。YTHDF2異位顯著下調野生型Atg5和Atg7片段的熒光素酶活性，這種減少完全被m6A共識位點的突變消除。檢測YTHDF2是否介導mRNA衰變從而控制Atg5和Atg7的表達，在3T3-L1細胞中進行功能缺失研究。敲低YTHDF2后 Atg5和Atg7的mRNA水平提高， mRNA穩(wěn)定性分析顯示YTHDF2缺失延長了Atg5和Atg7 mRNA轉錄物的半衰期。過表達FTO的3T3-L1細胞中ATG5和ATG7蛋白質水平的增加能部分被強表達YTHDF2逆轉，LC3-II：I也部分逆轉。異位表達YTHDF2可逆轉過表達FTO引起的促脂肪生成和甘油三酯積累。這些數(shù)據(jù)表明FTO調節(jié)ATG5和ATG7的表達，通過m6A依賴性和YTHDF2介導的方式。

6.脂肪選擇性缺失FTO可減少白色脂肪量并抑制ATG5和ATG7依賴性自噬
   研究FTO的體內作用，建立脂肪選擇性FTO敲除小鼠（fto-AKO）模型，fto-AKO小鼠的脂肪組織（WAT）FTO表達缺失，其他組織包括肌肉，肝臟，大腦，巨噬細胞或血管內皮細胞并沒有。相對于對照鼠，食物或高脂飲食（HFD）誘導fto-AKO小鼠的體重增加變弱，且更瘦，而兩組之間食物攝入沒有顯著差異。fto-AKO小鼠腹股溝脂肪和性腺脂肪的數(shù)量顯著低于同窩對照鼠。SAT和VAT的haematine和伊紅染色顯示HFD對照小鼠的脂肪細胞表現(xiàn)為一個大脂滴占據(jù)整個細胞的典型結構。相反，F(xiàn)TO缺乏導致多腔較小脂滴的脂肪細胞。喂食HFD的fto-AKO小鼠的血糖水平和血清甘油三酯水平的顯著低于對照鼠。脂肪選擇性缺失Fto減弱LC3-II：I比例和SQSTM1蛋白豐度升高，ATG5和ATG7的基因表達減弱，表明在WAT中自噬抑制。此外， fto-AKO小鼠WAT中Cebpb的mRNA水平下調，暗示fto敲除可能損害脂肪組織發(fā)育，通過抑制ATG5和ATG7-CEBPB信號。這些表明脂肪細胞選擇性fto敲除可能會減少WAT量和損害ATG5和ATG7依賴性自噬。

總結：
   FTO在促進自噬和脂肪生成中起作用，主要通過m6A-YTHDF2依賴機制。這些發(fā)現(xiàn)在預防和治療肥胖的研究進程中迸發(fā)出新的火花新的思路。