circNUSN2的m6A甲基化修飾促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移

   circRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可作為疾病的生物標(biāo)志物。circRNA表達(dá)異常已在不同的病理過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)，包括肝癌、膀胱癌、肺癌和口腔癌的發(fā)病機(jī)制。已有報(bào)道m(xù)6A修飾廣泛存在于circRNA中。但m6A修飾對(duì)circRNA的影響與調(diào)控機(jī)制及其在腫瘤進(jìn)展中的生物學(xué)意義尚不清楚。Nature Communications雜志發(fā)表了一篇circRNA m6A修飾的文章“N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis”，文章報(bào)道發(fā)現(xiàn)m6A修飾的circNSUN2可結(jié)合YTHDC1并促進(jìn)其出核，進(jìn)一步結(jié)合IGF2BP2穩(wěn)定HMGA2 mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移。
結(jié)果：
1.circNSUN2的表達(dá)分析
   我們使用兩對(duì)CRC和鄰近非腫瘤組織樣本進(jìn)行高通量circRNA微陣列。在這些基因組位點(diǎn)中，我們鑒定出38種調(diào)節(jié)異常的circRNA。其中，我們進(jìn)一步選取9個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且循環(huán)失調(diào)的環(huán)狀circRNAS作為候選（圖1a）。其中4種circRNA在超過(guò)75%的標(biāo)本中呈現(xiàn)出高表達(dá)的趨勢(shì)（圖1b）。另外，ircNSUN2高表達(dá)的組生存狀況顯著低于低表達(dá)組（圖1c）。而且與正常結(jié)直腸組織和腺瘤對(duì)照組相比，原發(fā)性CRCs中特別是LM的CRCs中circNSUN2表達(dá)顯著上升（圖1d）。此外，我們比較了從相同患者手術(shù)獲得的原發(fā)性CRCs （PC）和匹配的LM組織中circNSUN2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性CRCs組織相比，在LM組織中circNSUN2的表達(dá)顯著增加（圖1e）。與對(duì)照組的CRCs患者相比，患有LM的CRCs患者的血清circNSUN2表達(dá)也顯著升高（圖1f）。

2.CRCs中circNSUN2的鑒定
   我們通過(guò)RT-PCR、Sanger測(cè)序、RNase R處理和northern blot對(duì)HCT116細(xì)胞中的circNSUN2進(jìn)行分析。經(jīng)擴(kuò)增引物RT-PCR檢測(cè)，序列產(chǎn)物與circNUSN序列一致（圖2a）。對(duì)RNase R外切酶的耐消化性證實(shí)，該RNA物種具有環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)（圖2b）。然后，我們使用探針來(lái)區(qū)分circNSUN2及其宿主基因NSUN2（圖2c）。經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin d處理后，qRT-PCR分析顯示，circNSUN2的半衰期超過(guò)24小時(shí)，而相關(guān)線性轉(zhuǎn)錄物的半衰期約為4小時(shí)（圖2d），說(shuō)明circNSUN2在CRC細(xì)胞中更加穩(wěn)定。進(jìn)一步的核質(zhì)分離（圖2e）和熒光原位雜交（圖2f）檢測(cè)顯示，circNSUN2主要分布在胞質(zhì)中。這些結(jié)果共同揭示了circNSUN2是CRC中表達(dá)豐富而穩(wěn)定的circRNA。

3.circNSUN2促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移
   鑒于circNSUN2在CRC侵襲性中的重要臨床意義，我們研究了circNSUN2在CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的體內(nèi)功能。結(jié)果表明，在PDX CRC細(xì)胞中，circNSUN2表達(dá)下調(diào)后，無(wú)論是在肝臟（圖3a）還是肺（圖3c）轉(zhuǎn)移模型中，腫瘤轉(zhuǎn)移均受到明顯抑制。相比之下，通過(guò)過(guò)度表達(dá)circNUSN2注入TC71細(xì)胞的裸小鼠與對(duì)照組相比，肝臟（圖3b）或肺（圖3d）的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)明顯增多。

4.YTHDC1促進(jìn)m6A修飾的circNSUN2的細(xì)胞質(zhì)輸出
   為了探索circNSUN2調(diào)控CRC惡性腫瘤的潛在分子機(jī)制，我們首先進(jìn)行了RNA下拉實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析來(lái)篩選與circNSUN2相互作用的蛋白（圖4a）。我們驗(yàn)證了YTHDC1和IGF2BP2是推測(cè)的circNSUN2結(jié)合蛋白。進(jìn)一步的RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照相比，使用YTHDC1抗體沉淀的復(fù)合物中circNSUN2富集（圖4b）。由于YTHDC1是已知的m6A讀碼器，我們想知道circNSUN2是否含有m6A甲基化。通過(guò)甲基化RNA免疫沉淀分析，我們發(fā)現(xiàn)circNSUN2的外顯子5和外顯子4連接序列在m6A的析出分?jǐn)?shù)中得到了高度富集（圖4c），證實(shí)了circNSUN2中的m6A修飾。序列分析預(yù)測(cè)到了circNSUN2中存在GAACU motif，通過(guò)突變實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RNA探針中GAACU m6A基序或YTHDC1的m6A結(jié)合基序發(fā)生突變，YTHDC1與circNSUN2的相互作用能力下降（圖4e）。此外，核質(zhì)分離（圖4f）和FISH（圖4g）表明，YTHDC1的沉默顯著增加了細(xì)胞核circRNA的含量。YTHDC1野生型（WT）的強(qiáng)迫表達(dá)挽救了circNSUN2的細(xì)胞質(zhì)輸出缺陷?？傊?，這些結(jié)果證明YTHDC1可以與circNSUN2結(jié)合，從而促進(jìn)circNSUN2以m6A依賴(lài)的方式從 細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)輸出。

5.circNSUN2通過(guò)CAUCAU與IGF2BP2相互作用
   從RNA下拉實(shí)驗(yàn)中，我們首先觀察到circNSUN2被大量的IGF2BP2蛋白下拉（圖5a），進(jìn)一步的RNA免疫沉淀證實(shí)了IGF2BP2與circNSUN2之間的相互作用（圖5b）。通過(guò)免疫熒光和熒光原位雜交檢測(cè)，我們證實(shí)了胞質(zhì)中內(nèi)源性表達(dá)的circNSUN2和IGF2BP2的共域化（圖5c）。這些結(jié)果表明circNSUN2/IGF2BP2在細(xì)胞質(zhì)中形成了RNA蛋白復(fù)合物。另外，我們研究了IGF2BP2與circNSUN2相互作用的結(jié)構(gòu)域。RIP分析（圖5d）顯示，IGF2BP2的KH3-4-di-domain特異性地與circNSUN2結(jié)合。之前已報(bào)道IGF2BP2結(jié)合RNA的motif是CAUH （H = A、U或C），在circNSUN2中存在該基序，于是基于位點(diǎn)突變前后EMSA分析，我們驗(yàn)證了circNSUN2內(nèi)的CAUCAU是IGF2BP2相互作用所必需的（圖5e）。我們的數(shù)據(jù)揭示了IGF2BP2通過(guò)KH3-4–di-domain與circNSUN2的CAUCAU結(jié)合。

6.circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2復(fù)合物促進(jìn)HMGA2 mRNA穩(wěn)定
   由于IGF2BP2對(duì)mRNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要，我們接下來(lái)想知道circNSUN2/IGF2BP2復(fù)合物是否能穩(wěn)定某些未知的下游靶點(diǎn)。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了干擾circNSUN2前后分析轉(zhuǎn)錄組的差異情況，644個(gè)mRNA表達(dá)在circNSUN2沉默后顯著下降。據(jù)報(bào)道，IGF2BP2優(yōu)先與AU含量高的靶mRNAs的3’UTR結(jié)合。基于已發(fā)表的CLIP數(shù)據(jù)分析了這644種mRNA的情況，其中有21種mRNA可以結(jié)合IGF2BP2?？紤]到circNSUN2促進(jìn)了轉(zhuǎn)移進(jìn)程，結(jié)合qRT-PCR和WB驗(yàn)證，我們證實(shí)了HMGA2是circNSUN2的靶點(diǎn)。RNA下拉實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circNSUN2和HMGA2之間的相互作用（圖6a）。干擾circNSUN2后HMGA2的mRNA穩(wěn)定性顯著降低（圖6b）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、免疫熒光-FISH共定位分析和circNSUN干擾證明了circNSUN2在促進(jìn)IGF2BP2與HMGA2相互作用方面起著關(guān)鍵作用，并通過(guò)形成circNSUN2/ IGF2BP2/HMGA2 RNA蛋白三元復(fù)合物來(lái)提高HMGA2的 mRNA穩(wěn)定性（圖6c-f）。

7.circNSUN2通過(guò)HMGA2途徑促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移
   我們研究circNSUN2在CRC轉(zhuǎn)移中的作用是否依賴(lài)于HMGA2。體內(nèi)模型表明，干擾circNSUN2可抑制肝轉(zhuǎn)移，但同時(shí)過(guò)表達(dá)HMGA2則促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移（圖7a-e）。另外，為了揭示circNSUN2在CRC中的臨床相關(guān)性，我們檢測(cè)了97例CRC患者中circNSUN2和HMGA2的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)HMGA2的表達(dá)水平與circNSUN2的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)（圖7f）。接下來(lái)我們又檢測(cè)了20例CRC患者原發(fā)性和肝轉(zhuǎn)移組織中HMGA2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HMGA2的表達(dá)上調(diào)在肝轉(zhuǎn) 移中比在原發(fā)性組織中更為普遍（圖7g）。

結(jié)論：
circNSUN2與細(xì)胞核內(nèi)m6A結(jié)合蛋白YTHDC1結(jié)合，并且YTHDC1以m6A依賴(lài)的方式調(diào)控circNSUN2的出核定位。同時(shí)發(fā)現(xiàn)胞漿circNSUN2可與RNA結(jié)合蛋白IGF2BP2結(jié)合，并能直接結(jié)合下游HMGA2 mRNA，形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2 RNA-蛋白三元復(fù)合物，促進(jìn)HMGA2 mRNA穩(wěn)定性。進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)裸鼠轉(zhuǎn)移及體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，證明了circNSUN2通過(guò)促進(jìn)HMGA2mRNA的穩(wěn)定性進(jìn)而最終促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤的肝轉(zhuǎn)移。