揭秘BRG1與自噬依賴性氧化應(yīng)激的關(guān)系

   BRG1，SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的ATPase亞基，是維持腸上皮細(xì)胞(IECS)內(nèi)穩(wěn)態(tài)以防止炎癥和腫瘤發(fā)生所必需的，是直接調(diào)控Atg16l1，Ambra1，ATG7和Wipi2轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對(duì)自噬體生物發(fā)生非常重要。BRG1缺陷型IECS的缺陷自噬導(dǎo)致過量的活性氧(ROS)，從而導(dǎo)致屏障完整性的缺陷。自噬是綜合應(yīng)激反應(yīng)的核心組成部分，影響許多炎癥性疾病，包括炎癥性腸病(IBD)和結(jié)直腸癌(CRC)。雖然核心機(jī)制已知，但自噬的表觀遺傳調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)及其在結(jié)腸炎中的作用在很大程度上仍未確定。近期，一篇名為“BRG1 attenuates colonic inflammation and tumorigenesis through autophagy-dependent oxidative stress sequestration”的文章，在雜志《Nature Communications》上發(fā)表。該文章的研究重點(diǎn)是確定BRG1在結(jié)腸炎和結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的小鼠模型中解決炎癥的成人功能。使用損失和獲得功能的方法，證明BRG1確保結(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和耦合自噬依賴的ROS反應(yīng)。結(jié)果突出表明BRG1作為一個(gè)內(nèi)穩(wěn)態(tài)檢查點(diǎn)，抑制炎癥相關(guān)的CRC。

技術(shù)路線：

結(jié)果：
一、IBD患者上皮細(xì)胞BRG1表達(dá)降低
   BRG1減少和IBD發(fā)病機(jī)制之間存在因果關(guān)系。

圖一 IBD患者BRG1表達(dá)降低。a健康對(duì)照和IBD標(biāo)本中BRG1 mRNA的盒圖(使用數(shù)據(jù)集GSE9452和GSE3365)。 b RT-qPCR分析IBD標(biāo)本和健康受試者(n=81)中BRG1mRNA的表達(dá)。  c上圖顯示BRG1染色圖像，下圖顯示正常和炎癥性腸病活檢中上皮BRG1的表達(dá)(χ2檢驗(yàn))。染色指數(shù)使用10分量化標(biāo)度，分?jǐn)?shù)>4被認(rèn)為是較高的水平。

二、成年Brg1IEC-AKO小鼠自發(fā)發(fā)展結(jié)腸炎
   為了避免BRG1丟失導(dǎo)致的早期發(fā)育缺陷，采用VillinCre-ERT2/+小鼠在2個(gè)月齡時(shí)通過給藥tamoxifen的方法來切除BRG1。右旋糖酐硫酸鈉（DSS）是一種誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的化學(xué)物質(zhì)，具有IBD的臨床特征。

圖二 BRG1在成人腸道中的缺失導(dǎo)致結(jié)腸炎的發(fā)展。用tamoxifen治療2個(gè)月大的小鼠(Brg1flox/flox或VillinCre-ERT2；Brg1flox/flox)，從而產(chǎn)生Brg1F/F或Brg1IEC-AKO小鼠。a顯示了BRG1表達(dá)的免疫組織化學(xué)(上圖)和免疫印跡(IB)分析(下圖)。 b在指定的時(shí)間點(diǎn)顯示Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠中遠(yuǎn)端切片的代表性組織學(xué)圖像，并顯示組織病理學(xué)的半定量評(píng)分(n=12，每個(gè)基因型)。箭頭：免疫細(xì)胞浸潤。 c從16周齡小鼠(BRG1消融后2個(gè)月)分離的結(jié)腸固有層細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)(n=4)進(jìn)行分析。 d 16周齡小鼠結(jié)腸勻漿的RT-qPCR分析以評(píng)估細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生(每個(gè)基因型n=6).  e來自3月齡小鼠(BRG1切除后1個(gè)月)的小腸的Alcian blue-Periodic acid Schiff(AB-PAS；杯狀細(xì)胞)染色和溶菌酶(Lys；Paneth細(xì)胞)染色以及右側(cè)顯示的定量結(jié)果 (n=5)。 f 3%DSS處理后Brg1IEC-AKO小鼠與Brg1F/F小鼠存活率比較(n=10)。  g-i小鼠飲水中添加1%DSS喂養(yǎng)，并記錄體重(g)和結(jié)腸長度(h)的損失(n=10)。(i)從第10天1%DSS處理的小鼠收集的中遠(yuǎn)端結(jié)腸組織的H&E染色切片，以及在右側(cè)顯示的組織學(xué)評(píng)分定量。

三、Brg1丟失驅(qū)動(dòng)炎癥相關(guān)CRC
   Brg1IEC-AKO小鼠遭受持續(xù)炎癥的觀察，促使研究BRG1在結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤發(fā)生中的作用。因此，首先用單劑量的DNA甲基化試劑AOM治療小鼠，以確定它是否能使Brg1IEC-AKO小鼠發(fā)展腫瘤。為證實(shí)Brg1IEC-AKO小鼠中發(fā)生的慢性炎癥促進(jìn)上皮異型增生，接下來通過注射AOM誘導(dǎo)CRC，隨后進(jìn)行三個(gè)周期的1%DSS治療。在整個(gè)DSS治療期間記錄體重的變化，并在AOM治療12周后確定腫瘤負(fù)擔(dān)。

圖三 BRG1缺失促進(jìn)炎癥相關(guān)的CRC。 a AOM單獨(dú)治療方案。Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠7個(gè)月齡結(jié)腸H&E染色切片的代表性圖像(每個(gè)基因型n=10)。 b RT-qPCR分析7月齡小鼠全結(jié)腸勻漿中指示基因的相對(duì)mRNA水平(每個(gè)基因型n=5)。 c Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠于第0天(2月齡)注射AOM，并按指示用1%DSS治療3個(gè)4天周期。體重變化記錄如下(n=10每基因型)。 d AOM注射12周后，處死小鼠檢測(cè)腫瘤負(fù)荷(n=10)。 e每種基因型中結(jié)腸的代表性圖像和腫瘤的總體分級(jí)(χ2檢驗(yàn))(每種基因型n=10)。 f顯示了來自20周齡AOM/1%DSS處理的Brg1F/F和Brg1IEC-AKO的腫瘤中Ki67和裂解的caspase-3染色的代表性圖像(每個(gè)基因型n=4)。

四、BRG1過表達(dá)從結(jié)腸炎和結(jié)腸炎中保護(hù)小鼠
   為確定BRG1表達(dá)的升高是否可以密切地保護(hù)小鼠免受結(jié)腸炎的侵襲，構(gòu)建條件性Brg1過表達(dá)小鼠(R26BRG1/+)。為了誘導(dǎo)急性炎癥，我們用3%的DSS處理小鼠。

圖四 BRG1在IECS中過表達(dá)可保護(hù)小鼠免于結(jié)腸炎和腫瘤發(fā)生。a R26Brg1/+小鼠方案和BRG1在IECS(Brg1IEC-OE/+)小鼠中的條件性過表達(dá)。 b R26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠結(jié)腸組織BRG1表達(dá)的免疫組化和Western blotting分析。 c,d DSS治療5天，記錄結(jié)腸長度(C)和體重(D)(n=10)。 e 經(jīng)3%DSS處理的R26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠的代表性中遠(yuǎn)端結(jié)腸切片和組織學(xué)評(píng)分(右)(n=10)。箭頭表示免疫細(xì)胞浸潤。 f RT-qPCR分析未處理或DSS處理的小鼠(第5天，每個(gè)基因型n=4)全結(jié)腸勻漿中指示基因的相對(duì)mRNA水平。 g來自3%DSS處理的小鼠腸道的Alcian blue-Periodic acid Schiff(AB-PAS；杯狀細(xì)胞)染色和溶菌酶(Lys；Paneth細(xì)胞)染色，定量結(jié)果顯示在右側(cè)(n=5)。2月齡的小鼠接受AOM治療，隨后進(jìn)行3個(gè)周期的3%DSS治療。 h AOM治療3個(gè)月后小鼠的宏觀圖像，以及基于大小的腫瘤數(shù)量在右側(cè)面板中量化(每種基因型n=10)。 i H&E染色結(jié)腸切片的代表性圖像如圖所示；右側(cè)為腫瘤的百分比分級(jí)(n=10，χ2檢驗(yàn))。

五、BRG1介導(dǎo)ROS穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)屏障完整性
   腸屏障功能障礙經(jīng)常導(dǎo)致腸道炎癥。通過在嚴(yán)重結(jié)腸炎發(fā)病前檢查緊密連接蛋白1(ZO-1)、Claudin-1和E-cadherin的分布或表達(dá)來研究BRG1丟失是否損害了屏障完整性(3月齡小鼠檢查)。由于上皮細(xì)胞死亡是導(dǎo)致屏障完整性的主要因素之一，因此評(píng)估Brg1IEC-AKO小鼠中細(xì)胞存活的可能缺陷。為了解BRG1在結(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的機(jī)制作用，使用從7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠分離的IECS進(jìn)行了表達(dá)譜分析，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)BRG1缺失還沒有導(dǎo)致結(jié)腸炎。因此，表達(dá)改變可能反映了結(jié)腸中BRG1丟失的主要影響。為了提供更多的證據(jù)證明ROS是BRG1介導(dǎo)的結(jié)腸炎中的必要參與者，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定阻斷ROS是否可以逆轉(zhuǎn)由BRG1丟失引起的炎癥表型。為此，3月齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠在2個(gè)月齡時(shí)刪除BRG1后接受NAC治療1個(gè)月。

圖五 BRG1介導(dǎo)ROS反應(yīng)，控制細(xì)胞凋亡和結(jié)腸炎癥。a-c樣品均來自12周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠(注射tamoxifen后1個(gè)月)。 (a) 結(jié)腸切片中具有代表性的ZO-1和E-cadherin染色。 (b) 由血清中FITC-葡聚糖濃度測(cè)定結(jié)腸通透性(n=5/基因型)。 (c) TUNEL，裂解的caspase-3和Ki67染色(n=4)。 d IECS分離自Brg1flox/flox和VillinCre-ERT2；Brg1flox/flox或5天DSS處理的R26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠，BRG1缺失通過細(xì)胞中的4-OHT處理實(shí)現(xiàn)。相應(yīng)的命名為IECBrg1-F/F、IECBrg1F/F-CreERT2或IECBrg1/+、IECBrg1-OE/+。 e來自Brg1flox/flox和VillinCre-ERT2的有機(jī)化合物；Brg1flox/flox小鼠。培養(yǎng)5天后，用4-OHT處理或不用4-OHT處理，48小時(shí)后對(duì)7-AAD染色的有機(jī)物(RED)進(jìn)行成像(左)。每種有機(jī)物的熒光密度的定量(右)。 f C-Casp3染色的有機(jī)切片，如所示。 g 7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠(注射tamoxifen1周后)IECS基因表達(dá)變化的GO項(xiàng)分析。 h 7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠8-OHdG染色。 i直方圖和MFI量化從小鼠分離的IECS中的ROS，BRG1缺失通過4-OHT處理實(shí)現(xiàn)(n=4每個(gè)基因型)。 j IBD標(biāo)本中BRG1信號(hào)與ROS信號(hào)的相關(guān)性(Pearson‘s法)。 K-m 12周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠在BRG1缺失1個(gè)月后給予NAC處理，1個(gè)月后進(jìn)行分析。結(jié)腸長度 (k), H&E (l)和RT-qPCR分析(m) ，如所示(n=5每基因型)。

六、BRG1作為IECS中的自噬檢查點(diǎn)
   為了闡明BRG1調(diào)節(jié)ROS的分子基礎(chǔ)，從2個(gè)月齡的野生型IECS中提取BRG1結(jié)合的染色質(zhì)，進(jìn)行免疫共沉淀并進(jìn)行深度測(cè)序分析。CHIP-SEQ分析表明，12119個(gè)基因(26349個(gè)峰)在6kb的注釋基因范圍內(nèi)具有BRG1占有率。為了將染色質(zhì)結(jié)合與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)，chip-seq數(shù)據(jù)與表達(dá)譜對(duì)齊。一些證據(jù)表明，受損的自噬會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激。因此，推斷BRG1通過調(diào)節(jié)自噬調(diào)節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)。為了測(cè)試這種可能性，2個(gè)月齡Brg1flox/flox和VillinCre-ERT2；Brg1flox/flox或Rosa26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠的結(jié)腸中分離出IECS。為了在全基因組范圍內(nèi)區(qū)分BRG1結(jié)合位點(diǎn)和BRG1功能位點(diǎn)，在Brg1F/F和Brg1IEC-AKO IECS中進(jìn)行了H3K9ac(活性基因轉(zhuǎn)錄的組蛋白標(biāo)記)chip-seq。

圖六 BRG1調(diào)節(jié)IECS中的自噬以控制ROS和結(jié)腸炎癥。從Brg1flox/flox，VillinCre-ERT2；Brg1flox/flox或R26Brg1/+和Brg1IEC-OE/+小鼠中分離IECS，并且通過細(xì)胞中的4-OHT處理來實(shí)現(xiàn)BRG1缺失(以下稱為IECBrg1-F/F，IECBrg1-F/F-CreERT2或IECBrg1/+，IECBrg1-OE/+)。a顯示BRG1結(jié)合基因的數(shù)量并顯示BRG1-KO IECS表達(dá)變化的Venn圖(BRG1消融的1周)。右圖顯示了重疊基因的GO術(shù)語分析。 b heatmap總結(jié)了與自噬調(diào)節(jié)相關(guān)的基因表達(dá)的RNA-seq結(jié)果。 c免疫印跡顯示LC3轉(zhuǎn)換和p62水平。 d透射電鏡檢測(cè)自噬小體，并對(duì)7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠(BRG1缺失1周；每個(gè)基因型n=5)的結(jié)腸進(jìn)行定量。箭頭表示自噬小體，M：線粒體。 e 7周齡Brg1F/F和Brg1IEC-AKO小鼠結(jié)腸LC3-GFP染色。 F,g  LC3-GFP染色(f)和IECBrg1F/F-CreERT2經(jīng)4-OHT處理的指示蛋白的IB分析，如圖(g)所示。 h,i 加或不加氯喹(CQ 10μM)處理的IECBrg1-F/F和IEC-CreERT2中的IB分析(h)和LC3-GFP染色(i)。 j Venn圖顯示與BRG1，H3K9ac結(jié)合的重疊基因，并顯示BRG1-KO IECS中的表達(dá)變化。 k RT-qPCR分析IECS中指示的基因(BRG1KO或過表達(dá))，并通過熱圖(n=3)總結(jié)結(jié)果。 l 從野生型小鼠分離的IECS中Atg16l1，Wipi2，ATG7和Ambra1基因位點(diǎn)的BRG1 chip-Seq信號(hào)的快照。 m 芯片-qPCR分析IECS中Atg16l1，Wipi2，ATG7和Ambra1基因位點(diǎn)的BRG1結(jié)合和H3K9ac編碼，如所示(n=5，每個(gè)基因型)。箭頭指示芯片-qPCR引物對(duì)的位置。

七、BRG1調(diào)節(jié)自噬以控制IECS中的ROS反應(yīng)
   鑒于ATG16L1在自噬小體形成和結(jié)腸炎中的功能和臨床重要性，評(píng)估在BRG1缺失的IECS中Atg16L1的下調(diào)是否確實(shí)導(dǎo)致了失控的ROS反應(yīng)和細(xì)胞存活缺陷。因此，使用寡核苷酸在IECBrg1-F/F和IECBrg1-F/F；CreERT2中敲除(KD)Atg16l1。除了Atg1611外，BRG1直接調(diào)節(jié)Wipi2，ATG7和Ambra1，它們對(duì)自噬小體生物發(fā)生也很重要。為了進(jìn)一步闡明結(jié)腸炎癥中brg1和自噬之間的功能依賴性，產(chǎn)生了有條件地消融切除IECs 中自噬蛋白ATG5的VillinCre/+；Atg5flox/flox小鼠(Atg5IEC?/?).腸道微生物區(qū)系在疾病發(fā)展和進(jìn)展過程中起著驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)的重要作用。為了排除腸道微生物群參與BRG1缺乏引起的腸道屏障損害的可能性，通過用含有抗生素雞尾酒的飲用水治療Brg1IEC-AKO和Brg1F/F小鼠3周，然后用1%的DSS治療，產(chǎn)生了腸道微生物區(qū)系枯竭小鼠。通過16S rDNA測(cè)序證實(shí)腸道微生物區(qū)系耗盡。

圖七 BRG1保護(hù)結(jié)腸炎癥依賴于自噬的調(diào)節(jié)。a IECBrg1-F/F(對(duì)照)或IECBrg1-F/F-CreERT2(BRG1 KO)中指示蛋白的IB分析，帶有或不帶有ATG16L1敲除或恢復(fù)。 b 如圖所示，IECS中ROS水平的量化(每個(gè)基因型n=4)。 c 從小鼠分離的IECS中BRG1，ATG5和LC3的免疫印跡分析。 d-h在飲水中給藥DSS5天。結(jié)腸長度(d)和體重(e)記錄在IECS中具有或不具有ATG5缺失的R26Brg1+和Brg1IEC-OE/+小鼠中(n=8)。 f DSS治療9天后，來自所指示的小鼠基因型的結(jié)腸切片的組織學(xué)。 g RT-qPCR分析DSS處理小鼠結(jié)腸勻漿中相對(duì)mRNA表達(dá)水平(第9天；每個(gè)基因型n=5)。 h如所示，量化小鼠IECS中的ROS水平(每基因型n=4)。 i BRG1直接控制IECS中Atg16l1，Wipi2，ATG7和Ambra1等多層面自噬成分基因。因此，成年BRG1在IEC中的丟失導(dǎo)致自噬不足，導(dǎo)致過量的活性氧(ROS)，從而損害屏障完整性并促進(jìn)炎癥。代償性再生加上ROS誘導(dǎo)的DNA損傷促進(jìn)了CRC的惡性進(jìn)展。