一種新型LncRNA HITT與HIF-1α形成調(diào)節(jié)環(huán)，以調(diào)節(jié)血管生成和腫瘤生長

導(dǎo)語:
   越來越多的證據(jù)表明，長的非編碼RNA（lncRNA）在包括癌癥在內(nèi)的人類疾病中發(fā)揮著重要作用；但是，只有少數(shù)幾個經(jīng)過了實驗驗證和功能注釋。在這里，將確定了一種新的lncRNA，稱為HITT（翻譯水平的HIF-1α抑制劑）。在多種人類癌癥中，HITT通常會降低。HITT是缺氧轉(zhuǎn)換后變化最大的lncRNA之一，這篇文章將拓寬我們對lncRNA的癌癥相關(guān)功能的理解，突出了lncRNA–HIF-1α軸在癌癥的靶向治療中所具有的潛在影響。
技術(shù)路線:
1、人類結(jié)腸組織樣本的獲取以及結(jié)腸細(xì)胞系的培養(yǎng)
2、證明LncRNA HITT在人類癌癥中普遍減少
3、HITT以HIF-1α依賴性方式抑制血管生成和腫瘤生長
4、驗證HITT抑制HIF-1α翻譯且HITT充當(dāng)HIF-1α翻譯調(diào)節(jié)YB-1的誘餌
5、HIF-1α通過MiR-205介導(dǎo)的RNA降解
6、HIF-1α促進(jìn)HITT的降解并通過反饋回路降低了HITT的穩(wěn)定性
7、HITT下調(diào)與人類結(jié)腸癌組織中高水平的HIF-1α相關(guān)
研究結(jié)果:
1、LncRNA HITT通常在人類癌癥中減少
   快速擴(kuò)增3'-和5'-互補(bǔ)DNA末端分析證實HITT是具有聚腺苷酸化的20-50nt轉(zhuǎn)錄本位點。 HITT的編碼電勢值為0.387，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都檢測到了可比的HITT量。值得注意的是，HITT在分析的結(jié)腸癌組織中顯著下調(diào)。TCGA數(shù)據(jù)庫的分析顯示，HITT在多種癌癥類型中被下調(diào)。HITT通過以HIF-1α依賴性方式抑制血管生成來防止體內(nèi)腫瘤生長。在HCT116異種移植物中分別通過WB和qRT-PCR測量HIF-1α和VEGF蛋白和VEGF mRNA水平。這些發(fā)現(xiàn)共同表明HITT在人類癌癥中通常被下調(diào)。

2、HITT以HIF-1α依賴性方式抑制血管生成和腫瘤生長
   HITT可能通過拮抗有害的微環(huán)境因素來抑制腫瘤的生長。使用特異性靶向HIF-1α的siRNA抑制了HIF-1α的表達(dá)。HITT表達(dá)或HIF-1αKD降低了Ki-67的強(qiáng)度和血管密度。VEGF是已知的HIF-1α下游促血管生成靶標(biāo)被HITT抑制。使用體外模型驗證了HITT對HIF-1α誘導(dǎo)的血管生成的影響。HIF-1αKD還消除了低氧誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)和HUVEC分支，有趣的是，完全消除了HITT的抗血管生成作用。相反，HIF-1α的過表達(dá)可以挽救HITT抑制的HUVEC分支。總的來說，該發(fā)現(xiàn)表明HITT通過干擾HIF-1α依賴性信號來抑制血管生成和腫瘤生長。

3、HITT抑制HIF-1α的表達(dá)和活性
   HITT明顯降低了缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)約5至6倍，而HITT KD在常氧下增加了HIF-1α。HITT持續(xù)抑制HIF-1αmRNA表達(dá)約兩倍，而HITT KD促進(jìn)它的表達(dá)。表明HITT主要在蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)HIF-1α并且HITT對HIF-1α的抑制作用可能是特異性的。更重要的是，缺氧顯著增加了HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，并且在穩(wěn)定的HITT表達(dá)細(xì)胞系中這種作用被消除，而異位HIF-1α表達(dá)抑制了HITT的作用。另外，低氧增加了成熟的HIF-1α靶標(biāo)的表達(dá)，例如VEGF和血管生成素-1，而HITT顯著減弱了它的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)共同說明，HITT主要通過調(diào)節(jié)其HIF-1α的蛋白水平來抑制其轉(zhuǎn)錄活性。

4、HITT抑制HIF-1α翻譯
   在HITT轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定系和對照系中用蛋白合成抑制劑CHX處理細(xì)胞后，HIF-1α以相似的速率衰減。與多核糖體相關(guān)的HIF-1αmRNA隨缺氧而增加，重要的是，異位HITT表達(dá)損害了缺氧誘導(dǎo)的HIF-1αmRNA與多核糖體的結(jié)合，而HITT KD增加了它們的結(jié)合。相反，GAPDH mRNA的分布均保持不變。HITT的過表達(dá)抑制了新合成的HIF-1α蛋白，而HITT KD在缺氧條件下使其表達(dá)增加。新合成的α-微管蛋白用作陰性對照，并且未被異位HITT表達(dá)或KD改變。因此，HITT抑制HIF-1αmRNA的翻譯。

5、HITT充當(dāng)HIF-1α翻譯調(diào)節(jié)YB-1的誘餌
   HITT對HCT116裸鼠異種移植物的體外和體內(nèi)YB-1蛋白表達(dá)均無明顯影響，但HITT中預(yù)測了8個YB-1結(jié)合序列。 YB-1 KD降低了HIF-1α水平，而HITT失去了影響YB-1 KD細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的能力。HITT的富集顯著降低，而5'-UTR的富集響應(yīng)于低氧開關(guān)而增加。在缺氧條件下并同時廢除了HIF-1α 5'-UTR與YB-1的缺氧促進(jìn)的關(guān)聯(lián)。含有預(yù)測的YB-1結(jié)合基序的HITT有助于其與YB-1結(jié)合。表明HITT介導(dǎo)的HIF-1α抑制需要YB-1的結(jié)合。此外，YB-1 KD和異位HITT表達(dá)均阻止了低氧誘導(dǎo)的WTHIF-1α-5'-UTR-螢光素酶報道基因的活性，說明HITT直接與YB-1結(jié)合并阻止其與HIF-1α5'-UTR締合，從而導(dǎo)致HIF-1α翻譯減少。

6、HIF-1α通過反饋回路降低了HITT的穩(wěn)定性
   在低氧條件下，HITT顯著降低。si-HIF-1α降低了HIF-1α的水平，同時恢復(fù)了HITT的表達(dá)。相反，異位HIF-1α表達(dá)降低了HITT。HIF-2α對HITT的表達(dá)沒有任何明顯的影響，表明HITT受HIF-1α通過反饋回路的調(diào)控。在HITT的啟動子中沒有發(fā)現(xiàn)HRE基序，異位HIF-1α的表達(dá)和KD都不會對HITT啟動子驅(qū)動的熒光素酶活性產(chǎn)生顯著影響。缺氧會降低HITT的半衰期，而不降低GAPDH mRNA的半衰期。HIF-1αKD阻斷了缺氧的影響。在缺氧和缺氧的情況下，HIF-1α缺乏的786-O細(xì)胞中檢測到的HITT水平相當(dāng)。這些數(shù)據(jù)表明，HIF-1α決定了HITT的穩(wěn)定性。

7、HIF-1α通過MiR-205介導(dǎo)的RNA降解促進(jìn)HITT的降解
   HITT是MiR-205的候選靶標(biāo)。通過qRT-PCR驗證MiR-205可能介導(dǎo)HIF-1α誘導(dǎo)的下游分子，MiR-205抑制劑預(yù)防了低氧誘導(dǎo)的MiR-205，并且還恢復(fù)了低氧條件下降低的HITT水平，而在常氧條件下通過轉(zhuǎn)染MiR-205模擬物誘導(dǎo)的MiR-205顯著降低了HITT。 MiR-205模擬物還消除了缺氧條件下HIF-1αKD誘導(dǎo)的HITT恢復(fù)。此外，缺氧降低了WT HITT熒光素酶報道基因的活性。通過下拉生物素化的前體MiR-205和qRT-PCR，證實了MiR-205和HITT之間的直接締合。Ago2的KD是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物/ MiR-205的重要組成部分。 RIP Ago2顯示HITT與Ago2相關(guān)。這些數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個模型， Ago2 / miR-205在生理上與HITT結(jié)合，從而促進(jìn)了MiR-205介導(dǎo)的HITT降解。

8、HITT下調(diào)與人類結(jié)腸癌組織中高水平的HIF-1α相關(guān)
   發(fā)現(xiàn)了新穎的HITT–HIF-1α軸后，驗證了HIF-1α與HITT在人類癌癥組織中的表達(dá)之間的相關(guān)性。 在人結(jié)腸癌組織和匹配的對照中檢測了HIF-1α及其靶標(biāo)VEGF的蛋白水平（n = 46）。與匹配的正常對照相比，結(jié)腸癌組織中的HIF-1α和VEGF蛋白水平通常升高。降低的HITT水平與增加的HIF-1α蛋白和VEGF mRNA表達(dá)密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)與體外和異種移植數(shù)據(jù)相結(jié)合，證明HITT在翻譯水平上調(diào)節(jié)HIF-1α，這導(dǎo)致HIF-1α及其靶標(biāo)的表達(dá)降低。

總結(jié):
   癌細(xì)胞中HITT表達(dá)的恢復(fù)以HIF-1α依賴性方式抑制體內(nèi)的血管生成和腫瘤生長。研究表明HITT主要通過干擾其翻譯來抑制HIF-1α的表達(dá)。HITT通過高嚴(yán)格的YB-1結(jié)合基序從HIF-1αmRNA的5'- UTR滴定YB-1。HITT和HIF-1α表達(dá)之間的反向相關(guān)性在人結(jié)腸癌組織中得到進(jìn)一步證實。此外，缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)需要HITT下調(diào)。進(jìn)一步證明HITT和HIF-1α形成了一個自動調(diào)節(jié)反饋回路，其中HIF-1α通過誘導(dǎo)直接靶向HITT降解的MiR-205破壞了HITT的穩(wěn)定性。突出了HITT–HIF-1α軸構(gòu)成了另一層血管生成和腫瘤生長的調(diào)節(jié)層，對治療靶向具有潛在的影響。
   綜上所述，我們已經(jīng)鑒定出HITT，一種新型的lncRNA。我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了新發(fā)現(xiàn)的HITT–HIF-1α軸在調(diào)節(jié)血管生成和腫瘤生長中的重要性。HITT介導(dǎo)的HIF-1α合成的分子機(jī)制的詳細(xì)剖析提供了通過恢復(fù)HITT活性抑制HIF-1α的新策略的見解。