人肺腺癌和鱗狀細胞癌中環(huán)狀RNA的RNA-Seq分析

導語：
   新興證據(jù)表明，環(huán)狀RNA（circRNA）在腫瘤中異常表達，可以作為癌癥的預后標志物。但是，circRNA在非小細胞肺癌（NSCLC）中的表達模式和臨床意義仍然不清楚。在這項研究中，分析了10對肺腺癌(LUAD)和鱗狀細胞癌(LUSC)患者中核糖體RNA缺失和富集circRNA的RNase R消耗后環(huán)狀RNA的表達情況。從而探索circRNA在NSCLC中的重要診斷潛力。

技術(shù)路線：
1.人肺腫瘤及其鄰近的正常組織的收集與獲取
2.人肺腫瘤及其鄰近正常組織中的CircRNA分析
3.鑒定和驗證LUAD和LUSC組織中差異表達的circRNA
4.circRNA的驗證和定量，circRNA用于NSCLC診斷的潛在生物標志物

研究結(jié)果：
1、人肺腫瘤及其鄰近正常組織中的CircRNA分析
   RNase R消化后，從NSCLC腫瘤及其相應的正常組織中提取10對RNA樣品，進行高通量RNA測序。在所有5個程序中總共發(fā)現(xiàn)了17,952個circRNA，其中近98.84％包含至少2個獨特的反向拼接reads（圖1a，附圖S1a）?？梢杂^察到，這些重疊的circRNA普遍存在于整個基因組區(qū)域（圖1b）。如圖1c所示，與篩選出的circRNA相對應的將近60.8％的宿主基因可以產(chǎn)生至少2個circRNA。盡管無處不在整個基因組區(qū)域，但大多數(shù)circRNA都是從外顯子區(qū)域反向剪接的，主要（77.4％）由2-5個外顯子組成（圖1d）。此外，大多數(shù)circRNA的長度（91.7％）在200至1200個核苷酸之間（圖1e；附加文件2：表S5）。在這些篩選出的circRNA中，已經(jīng)在circBase數(shù)據(jù)庫中記錄了15,359個，其中包含140,790個人類circRNA[5]，因此2593個被認為是新穎的（圖1f）。

2、鑒定和驗證LUAD和LUSC組織中circRNA的差異表達
   比較NSCLC腫瘤中circRNA的表達與其相應的正常組織中的circRNA的表達，發(fā)現(xiàn)50個circRNA在LUAD組織中差異表達，校正后的p值≤0.05，倍數(shù)變化≥2（圖2a，附加文件3：圖S2a）。使用相同的嚴格標準，觀察到172個circRNA在LUSC組織中具有明顯的差異表達（圖2a，附加文件3：圖S2b），并且26個circRNA在LUAD和LUSC組織中均差異表達（圖2b）。為了驗證，使用跨越各自連接位點的F1 / R1特異性異源引物組對每個circRNA進行PCR（圖2c和g，附加文件3：圖S3a和g）。PCR產(chǎn)物的Sanger測序結(jié)果證實了所有4個選定circRNA的反向剪接連接位點的存在（圖2d和h，附加文件3：圖S3b和h），與circBase一致。然后，我們使用不同的F2 / R2發(fā)散引物對每個circRNA進行qPCR，其中F2穿過各自的circRNA連接位點。LUAD和LUSC組織中hsa_circ_ 0001821的上調(diào)和hsa_circ_0077837的下調(diào)首次在分析樣本中得到驗證（圖2e和i），然后在獨立的患者樣本隊列中得到證實（圖2f和j）。同樣，已確認hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495在NSCLC腫瘤中以亞型特異性模式異常表達，即hsa_circ_0001073僅在LUAD組織中被下調(diào)，而hsa_circ_ 0001495僅在LUSC組織中表現(xiàn)出較高的表達（其他文件3：圖S3c-f，il）。這些不同，circRNA的NSCLC亞型特異性失調(diào)表明了它們的亞型特異性生物學功能。

3、circRNA在NSCLC診斷中的潛在生物標志物
   如圖3a和b所示，曲線下面積（AUC）可以將NSCLC與正常組織區(qū)分開，hsa_circ_0077837的曲線下面積為0.921（95％CI：0.868-0.975），而hsa_circ_0001821的曲線下面積為0.81（95％CI：0.797-0.929），暗示這兩種circRNA在NSCLC患者中具有較高的診斷潛力。另一方面，LUAD組織中hsa_circ_0001073的AUC為0.919（圖3c），LUSC組織中hsa_circ_0001495的AUC為0.965（圖3d），這意味著hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495已在NSCLC亞型中異常表達。這種特異性模式可以用作診斷生物標志物，分別預測LUAD和LUSC。

總結(jié):
   在這項研究中，我們分析了NSCLC中circRNA的表達，包括LUAD和LUSC腫瘤及其鄰近的正常組織，發(fā)現(xiàn)LUAD和LUSC組織不僅具有共同的差異表達模式，而且還具有獨特的circRNA表達特征。此外，ROC分析表明，hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821對NSCLC非小細胞肺癌患者具有診斷潛力，而hsa_circ_ 0001073和hsa_circ_0001495可作為NSCLC非小細胞肺癌病理亞型的生物標志物。