標(biāo)書新亮點(diǎn)——鐵死亡

   鐵死亡是一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，其特征是致命脂質(zhì)活性氧物質(zhì)的鐵依賴性積累，有助于組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和多種病理，可用于治療。然而，細(xì)胞對鐵死亡的敏感性不同，一個(gè)關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是理解導(dǎo)致耐藥性的機(jī)制。2019年11月14日發(fā)表的新研究“Prominin2 Drives Ferroptosis Resistance by Stimulating Iron Export”，該文通過結(jié)合細(xì)胞外泌體深入研究，揭示了鐵死亡抗性可以由Prominin2-MVB-外泌體蛋白途徑驅(qū)動(dòng)，并對鐵穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和癌癥具有廣泛的意義。

亮點(diǎn):
1)前鐵感受器刺激誘導(dǎo)蛋白Prominin2的表達(dá)
2)Prominin2促進(jìn)上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的鐵死亡抗性
3)Prominin2促進(jìn)含有鐵蛋白的多泡體和外泌體的形成
4)鐵蛋白胞外運(yùn)出細(xì)胞抑制鐵死亡

結(jié)果:
一、Prominin2由鐵依賴應(yīng)力誘導(dǎo)并促進(jìn)對鐵依賴細(xì)胞死亡的抗性

   為了深入了解促進(jìn)鐵死亡抗性的機(jī)制，采用核糖核酸測序法比較了粘附和細(xì)胞外基質(zhì)分離的永生化乳腺上皮細(xì)胞中的基因表達(dá)。與貼壁細(xì)胞相比，PROM2編碼pentaspanin蛋白prominin2在細(xì)胞外基質(zhì)分離細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。此外，它被認(rèn)為在脂質(zhì)動(dòng)力學(xué)和膜組織中有作用，這些過程可能與鐵死亡抗性相關(guān)。經(jīng)證實(shí)，在蛋白質(zhì)和基因水平(圖1A和1B)。在分離的和粘附的Hs578t乳腺癌細(xì)胞(圖1B)。在MCF10A和Hs578t細(xì)胞中prominin2表達(dá)的沉默導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)分離條件下生存力的顯著喪失(圖1B和1C)。通過與鐵死亡的特異性抑制因子ferrostatin-1，但不能與泛半胱天冬酶抑制劑ZVAD-fmk共同治療 (圖1C)。這些數(shù)據(jù)表明，在細(xì)胞外基質(zhì)脫離后未能上調(diào)PROM2可能導(dǎo)致鐵死亡。

                                           圖1Prominin2是一種鐵死亡應(yīng)激反應(yīng)蛋白
   我們接下來研究GPX4的藥理學(xué)抑制是否改變了粘附細(xì)胞中的prominin2表達(dá)并影響了鐵死亡。MCF10A和Hs578t細(xì)胞用共價(jià)GPX4抑制劑RSL3處理2 h，導(dǎo)致兩種細(xì)胞系中prominin2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加(圖1d和1E)。與MCF10A和Hs578t細(xì)胞不同，RSL3在另一種乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞(圖1d和1E)。prominin2表達(dá)的誘導(dǎo)與GPX4抑制誘導(dǎo)的對鐵死亡的抗性相關(guān)。在高達(dá)2.5微米的濃度下，MCF10A和Hs578t細(xì)胞對arsenic bloom誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有抗性，而arsenic bloom濃度低至0.5微米(圖1f)。
對照MCF10A細(xì)胞比Hs578t細(xì)胞對這些化合物更具抗性(圖2A和2B)。與兩種細(xì)胞系的對照細(xì)胞相比，在prominin2敲除細(xì)胞中觀察到對所有四種化合物的敏感性顯著增加(圖2B)。 Ferrostatin-1完全彌補(bǔ)了Prominin2缺失細(xì)胞中細(xì)胞活力的喪失，這表明Prominin2沉默的細(xì)胞對敏感性的提高并不是由細(xì)胞死亡的另一種模式引起的(圖2C)。在MDA-MB-231細(xì)胞中，外源性Prominin2的表達(dá)足以抑制響應(yīng)RSL3、ML210、FIN56和erastin (圖2D)。prominin2的表達(dá)促進(jìn)了對鐵死亡的抗性。隨后的實(shí)驗(yàn)使用RSL3作為原型GPX4抑制劑。

                                           圖2 Prominin2增加對鐵死亡的抵抗力

二、Prominin2促進(jìn)多囊體和外泌體的形成
   為了深入了解prominin2如何促進(jìn)鐵死亡抗性，我們評(píng)估了GPX4抑制后的亞細(xì)胞定位。免疫熒光顯微鏡顯示，prominin2定位于離散的細(xì)胞質(zhì)點(diǎn)，以響應(yīng)RSL3(圖3A)。在prominin2和TSG101(多囊體的標(biāo)志)之間觀察到顯著的共定位 (圖3A)。早在GPX4被抑制后30分鐘，prominin2和TSG101的共定位就很明顯，這種共定位在核周區(qū)(圖3B)。在后期(1.5-2小時(shí))，這種共定位在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中是明顯的。

                                           圖3 Prominin2在GPX4抑制作用下促進(jìn)微血管生成
   上述結(jié)果促使我們評(píng)估prominin2是否響應(yīng)GPX4抑制作用促進(jìn)MVB的形成。RSL3處理的MCF10A和Hs578t細(xì)胞比載體對照處理的細(xì)胞含有更多的TSG101陽性結(jié)構(gòu)，表明GPX4抑制誘導(dǎo)MVB形成(圖3A、3B)。R使用透射電子顯微鏡（TEM）評(píng)估了這些結(jié)構(gòu)的形成是否取決于prominin2。實(shí)際上，經(jīng)RSL3處理的MCF10A細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞所含的MVB比對照細(xì)胞要多得多，這在Prominin2沉默的細(xì)胞中未觀察到(圖3C)。免疫熒光顯示，與對照細(xì)胞相比，缺失prominin2的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中TSG101陽性點(diǎn)減少(圖3D、3E)。相反，在MDA-MB-231細(xì)胞中外源性Prominin2的表達(dá)增加了TSG101陽性結(jié)構(gòu)的數(shù)量，并且如上所述，降低了鐵死亡敏感性(圖3F)。與MVBs在鐵死亡抗性中的因果作用一致，TSG101表達(dá)的減少增加了MCF10A和Hs578t細(xì)胞對RSL3誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的敏感性(圖4A、4B）這一死亡是用ferrostatin-1(圖4C)。這些數(shù)據(jù)表明GPX4的抑制刺激prominin2的表達(dá)和prominin2依賴的MVB形成，這促進(jìn)了鐵死亡抗性。

                                                 圖4逃避鐵死亡需要多泡體的形成
   微血管中不同的ilv，與外泌體的大小一致(80納米) 在RSL3處理的細(xì)胞中(圖3C)。為了評(píng)估GPX4抑制對胞外泌體形成的影響，通過超速離心從對照(DMSO)和RSL3處理的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中收集胞外泌體。GPX4的抑制增加了胞外泌體的形成，這可以從RSL3處理的細(xì)胞的胞外泌體制劑中存在大量蛋白質(zhì)的事實(shí)來證明(圖4D)。相反，對照細(xì)胞中的胞外泌體蛋白在該實(shí)驗(yàn)中沒有檢測到(數(shù)據(jù)未顯示)。通過免疫印跡分析顯示，這些外泌體含有prominin2、CD63和TSG101，是由prominin2依賴性MVB形成(圖4D)。通過使用鞘磷脂酶抑制劑GW4869，發(fā)現(xiàn)抑制胞外泌體釋放增加了對照MCF10A和Hs578t細(xì)胞對RSL3的敏感性，但它并不顯著影響缺失prominin2細(xì)胞(圖4E)。

三、MVB/外泌體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)有助于抗鐵死亡
   鐵蛋白與prominin2共定位于RSL3處理的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中，但不在載體對照(DMSO)處理的細(xì)胞(圖5A)。鑒定了從這些細(xì)胞中收獲的胞外泌體中的鐵蛋白(圖5B)。抑制GPX4后，MDA-MB-231細(xì)胞不增加鐵蛋白表達(dá)。與對照細(xì)胞相比，外源性prominin2的表達(dá)誘導(dǎo)了在RSL3處理中鐵蛋白定位的更點(diǎn)狀模式(圖5C)。

                                             圖5 Prominin2和鐵蛋白有助于游離鐵的調(diào)節(jié)
   鐵蛋白重鏈(FTH1)和輕鏈(FTL)MCF10A和Hs578t細(xì)胞中GPX4抑制引起的細(xì)胞死亡增加(圖5D、5E)。鐵死亡是由ferrostatin-1或鐵螯合劑去鐵胺(DFO)挽救的(圖5F)。當(dāng)prominin2或FTH1和FTL都被沉默時(shí)，Three chlorinated silica處理后游離鐵濃度增加(圖6A、6B)。通過響應(yīng)GPX4抑制的表達(dá)prominin2的MDA-MB-231細(xì)胞中的Prominin2表達(dá)阻止了在對照細(xì)胞中觀察到的響應(yīng)RSL3的鐵的增加(圖6C)。此外，通過降低TSG101的表達(dá)來阻斷MVB途徑顯著增加GPX4抑制后細(xì)胞內(nèi)游離鐵的濃度(圖6D)。這些結(jié)果表明阻斷MVB/外泌體介導(dǎo)的鐵蛋白輸出導(dǎo)致GPX4抑制時(shí)細(xì)胞內(nèi)鐵的積累。

                                                 圖6 GPX4抑制會(huì)改變游離鐵濃度
 
四、細(xì)胞外基質(zhì)分離細(xì)胞通過Prominin2介導(dǎo)的MVB/外泌體形成抵抗鐵死亡
   鐵螯合劑去鐵胺拯救了細(xì)胞外基質(zhì)分離的、Prominin2缺失的MCF10A和Hs578t細(xì)胞中的細(xì)胞死亡，這與鐵輸出促進(jìn)細(xì)胞死亡的缺陷一致(圖7A)。與對照細(xì)胞相比，細(xì)胞外基質(zhì)的分離增加了缺失prominin2中游離鐵的濃度，這種效應(yīng)在分離后2 h最為明顯，這與鐵死亡的開始(圖7B)。與Three chlorinated silica處理的貼壁細(xì)胞相似，細(xì)胞外基質(zhì)分離增加了微血管密度的頻率，這種增加依賴于Prominin2(圖7C)。外泌體釋放通過MVB與質(zhì)膜的融合來指示(圖7C)。在細(xì)胞外基質(zhì)分離的MCF10A和Hs578t細(xì)胞(圖7D)，類似于在粘附的、RSL3處理的細(xì)胞中觀察到的共定位(圖3A)。這些結(jié)果表明，生理性鐵中毒應(yīng)激可以通過prominin2/MVB鐵輸出途徑得以逃避。

                                         圖7脫離細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)Prominin2依賴性MVB形成挽救鐵死亡

結(jié)論：
   Prominin2促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的鐵下垂抗性。從機(jī)理上講，prominin2促進(jìn)了含有鐵蛋白的多泡體(MVBs)和將鐵運(yùn)出細(xì)胞的外體的形成，抑制了鐵死亡。這些發(fā)現(xiàn)揭示了鐵死亡抗性可以由Prominin2-MVB-外體蛋白途徑驅(qū)動(dòng)，并對鐵穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和癌癥具有廣泛的意義。