METTL3介導(dǎo)的HDGF mRNA m6A修飾促進(jìn)胃癌進(jìn)展

   m6A甲基化被認(rèn)為是真核mRNA中最豐富、最普遍的修飾。m6A修飾的作用包括調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、剪切、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯和RNA蛋白質(zhì)交互。在過去的幾年中，m6A調(diào)節(jié)因子的生物學(xué)功能被報(bào)道與干細(xì)胞分化、組織發(fā)育、晝夜節(jié)律周期和腫瘤進(jìn)展相關(guān)。然而，m6A的生物學(xué)意義以及其在人類胃癌（GC）中的潛在調(diào)控機(jī)制仍不清楚。那么小編為大家介紹一篇最近發(fā)表在期刊Gut上的文章：“METTL3-mediated m6A modification of HDGF mRNA romotes gastric cancer progression and has rognostic significance”。在本研究中，我們揭示了METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在GC中的生物學(xué)作用，并提出METTL3可能是一種新的預(yù)測(cè)GC進(jìn)展的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

結(jié)果：
1.METTL3表達(dá)升高與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)
   為了闡明m6A修飾在胃癌中的功能作用，我們首先檢測(cè)了28個(gè)胃癌組織和正常胃粘膜的m6A RNA水平。通過dot blot和ELISA檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)GC組織中的m6A RNA水平明顯升高（圖1A，1B）。其中甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在GC中顯著上調(diào)（圖1C，1D）。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，METTL3 mRNA水平升高的GC患者總體生存較差（圖1E）。與上述結(jié)果一致，經(jīng)western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，86%人胃癌組織中METTL3蛋白水平明顯高于正常胃組織（圖1F）。這些結(jié)果在胃癌組織芯片中得到證實(shí)，經(jīng)免疫組化染色顯示，胃癌組織中METTL3的表達(dá)較正常胃組織明顯增加（圖1 G，H）。此外，METTL3表達(dá)增高的胃癌患者5年總生存期較差（圖I）。多元回歸分析表明，METTL3是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)患者的預(yù)后的標(biāo)志GC（圖1 J）。為了進(jìn)一步評(píng)估METTL3表達(dá)的預(yù)測(cè)能力，我們進(jìn)行了時(shí)間依賴的接受者操作特征曲線分析，結(jié)果顯示，臨床風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(TNM期)和METTL3風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的聯(lián)合作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單獨(dú)的GC隊(duì)列中的任何一個(gè)（圖1K）。綜上所述，m6A修飾和METTL3水平在GC中有所升高，METTL3可能是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

2.p300介導(dǎo)的H3K27ac激活GC中METTL3的轉(zhuǎn)錄
   為了探索METTL3在GC中的高表達(dá)機(jī)制，我們首先通過UCSC基因組生物信息學(xué)位點(diǎn)分析了METTL3啟動(dòng)子的修飾。如圖2A所示，在METTL3的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)大量的H3K27乙酰化（H3K27ac）信號(hào)，提示METTL3可能受染色質(zhì)乙酰化調(diào)控。然后，我們用靶向P300的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑C646處理HGC-27細(xì)胞，結(jié)果顯示METTL3表達(dá)明顯下降，呈時(shí)間和劑量依賴性，HGC-27細(xì)胞未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性（圖2B-D）。使用western blot檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)C646處理后H3K27ac和METTL3蛋白水平下降（圖2E）。接下來，我們使用特定的siRNAs敲除P300（圖2F），發(fā)現(xiàn)P300的敲除顯著降低了METTL3的mRNA和蛋白水平（圖2G，H）。此外，染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，METTL3的啟動(dòng)子區(qū)域在P300結(jié)合和H3K27ac信號(hào)中富集，P300的敲除可以顯著降低METTL3啟動(dòng)子中H3K27ac信號(hào)的富集（圖2I，J）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，p300介導(dǎo)的METTL3啟動(dòng)子H3K27ac活化可能是METTL3上調(diào)的部分原因（圖2K）。

3.METTL3促進(jìn)GC增殖和血管生成
   為了研究METTL3在GC中的作用，我們建立了穩(wěn)定的過表達(dá)METTL3的GC細(xì)胞（圖3A）。METTL3的上調(diào)顯著提高了GC細(xì)胞軟瓊脂菌落形成效率(圖3B)和克隆能力（圖3C）。我們還檢測(cè)METTL3提升GC細(xì)胞增殖是否依賴于其m6A催化活性。與野生型細(xì)胞相比，催化突變的METTL3能顯著降低BGC823細(xì)胞的m6A水平（圖3D）。此外，METTL3的m6A催化活性對(duì)于促進(jìn)BGC823細(xì)胞的克隆能力是必不可少的（圖3E）。我們還建立了穩(wěn)定的METTL3敲除的GC細(xì)胞。在METTL3敲除或敲除后，m6A水平顯著降低（圖3F）。敲除METTL3明顯抑制軟瓊脂菌落形成效率和克隆能力（圖3G，H）。另外，過表達(dá)METTL3大大促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)（圖3 I-K）。IHC結(jié)果顯示與對(duì)照相比，METTL3過表達(dá)組的腫瘤組織增加（圖3L）。為了進(jìn)一步研究METTL3在胃癌血管生成中的作用，我們?cè)隗w外研究了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的生長(zhǎng)和成管過程。過表達(dá)METTL3的BGC823細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯著增加了管的形成和HUVEC生長(zhǎng)（圖3M）。我們還建立了3例不同類型的胃癌患者的器官樣體模型，進(jìn)一步驗(yàn)證METTL3的潛在臨床價(jià)值。結(jié)果表明，慢病毒過表達(dá)METTL3可顯著促進(jìn)三種不同類型GC器官中GC細(xì)胞的增殖（圖3N）。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3可能是一種致癌基因，其m6A催化活性可促進(jìn)胃癌的增殖和血管生成。

4.METTL3促進(jìn)胃癌的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移
   為了確定METTL3在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用，我們首先在體外進(jìn)行了遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯示METTL3的異位表達(dá)促進(jìn)了BGC823和AGS細(xì)胞的遷移和侵襲（圖4A，B）。然而，在HGC-27和NCI-N87細(xì)胞中，METTL3敲除產(chǎn)生相反的作用（圖4C）。我們進(jìn)一步評(píng)估了METTL3對(duì)胃癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。通過裸小鼠脾靜脈注射過表達(dá)METTL3的BGC823 -熒光素酶細(xì)胞及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞。8周后，METTL3的上調(diào)明顯促進(jìn)了GC肝轉(zhuǎn)移，生物熒光成像顯示，與對(duì)照組相比，METTL3的上調(diào)明顯促進(jìn)了GC肝轉(zhuǎn)移（圖4D-F）。相比之下，METTL3缺乏的NCI-N87細(xì)胞顯著抑制了GC肝轉(zhuǎn)移（圖4G，H）?？傊@些結(jié)果表明METTL3在促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。

5.METTL3介導(dǎo)的HDGF mRNA m6A修飾維持了其依賴IGF2BP3的穩(wěn)定性
   為了明確METTL3促進(jìn)胃癌進(jìn)展的分子機(jī)制，我們對(duì)METTL3過表達(dá)和敲除的GC細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序，并對(duì)METTL3過表達(dá)的GC細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行m6A修飾的RNA免疫沉淀測(cè)序（圖5A）。通過分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確定了HDGF mRNA m6A修飾（圖5B-G）。METTL3過表達(dá)的免疫純化RNA中AGACC motif高度富集（圖5H）， METTL3上調(diào)時(shí)HDGF mRNA中的m6A豐度顯著增加（圖5I）。另外，m6A特異性抗體顯著富集了METTL3過表達(dá)的HDGF mRNA，而m6A特異性抗體顯著降低METTL3敲除對(duì)HDGF mRNA的富集（圖5J）。考慮到m6A修飾對(duì)HDGF的mRNA水平具有正向調(diào)節(jié)作用，我們進(jìn)而研究m6A修飾是否影響HDGF mRNA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，METTL3過表達(dá)時(shí)HDGF mRNA水平高度穩(wěn)定，敲除METTL3則相反（圖5K）。此外，據(jù)報(bào)道HDGF是IGF2BP1/2/3的高通量測(cè)序結(jié)果的靶標(biāo)之一。因此，我們探討了IGF2BP1/2/3對(duì)HDGF mRNA穩(wěn)定的影響。其中只有IGF2BP3的下調(diào)顯著抑制HDGF mRNA的表達(dá)（圖5L）。與IgG對(duì)照抗體相比，IGF2BP3特異性抗體在RIP-qPCR檢測(cè)中顯著富集HDGF mRNA（圖5K）。接下來，我們比較了28個(gè)GC組織和TCGA數(shù)據(jù)中HDGF和IGF2BP3的mRNA水平。結(jié)果顯示，與正常胃組織相比，胃癌組織中HDGF和IGF2BP3的表達(dá)顯著上調(diào)（圖5N-Q）。我們還發(fā)現(xiàn)METTL3和IGF2BP3的表達(dá)與HDGF的表達(dá)顯著相關(guān)（圖5R，S）。我們也進(jìn)行腫瘤異種移植研究。結(jié)果表明，敲低METTL3、HDGF和IGF2BP3可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖5T-V）。

6.METTL3通過上調(diào)HDGF表達(dá)來加速GC惡性過程
   為了進(jìn)一步表征HDGF在GC中的致癌功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了三種不同的針對(duì)HDGF的siRNAs，并通過qRT-PCR和western blotting證實(shí)了它們的敲除效率（圖6A）。HDGF的下調(diào)顯著抑制了菌落形成、細(xì)胞遷移和侵襲以及HUVEC的生長(zhǎng)和成管（圖6B-D）。此外，HDGF重組蛋白挽救了METTL3敲除GC細(xì)胞的集落形成能力（圖6E）。與預(yù)期一樣，在METTL3過表達(dá)的AGS細(xì)胞中，HDGF的表達(dá)被其特異性的siRNAs敲除，從而顯著抑制了METTL3誘導(dǎo)的GC細(xì)胞遷移和侵襲（圖6F）。此外，HDGF的敲低明顯抑制METTL3誘導(dǎo)的 GC體內(nèi)生長(zhǎng)和血管生成（圖6G-J）。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，METTL3通過上調(diào)HDGF表達(dá)來促進(jìn)GC惡性進(jìn)展。

7.METTL3通過HDGF激活的GLUT4和ENO2的表達(dá)來促進(jìn)GC中的糖酵解
   我們研究METTL3是否調(diào)節(jié)糖酵解促進(jìn)GC惡性過程。如圖7A，B所示，上調(diào)BGC823細(xì)胞中METTL3的表達(dá)可顯著增加葡萄糖攝取和乳酸的產(chǎn)生。為了研究HDGF是否能恢復(fù)METTL3敲除細(xì)胞的糖酵解活性，我們將HDGF過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到METTL3敲除細(xì)胞中。結(jié)果表明HDGF過表達(dá)可恢復(fù)METTL3敲除GC細(xì)胞的糖酵解活性，并顯著增加乳酸產(chǎn)量（圖7C）。細(xì)胞外酸化速率動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)一步表明，過表達(dá)METTL3的BGC823細(xì)胞的糖酵解活性顯著增加，而敲除METTL3的HGC-27細(xì)胞的糖酵解活性下降（圖7D，E）。為了進(jìn)一步研究METTL3調(diào)控糖酵解的機(jī)制，我們檢測(cè)了METTL3過表達(dá)和METTL3敲除的GC細(xì)胞中與葡萄糖代謝相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄（圖7F）。我們還檢測(cè)了這些基因是否受HDGF調(diào)控，并檢測(cè)了HDGF敲低GC細(xì)胞中與葡萄糖代謝相關(guān)的基因（圖7G）。發(fā)現(xiàn)只有GLUT4和ENO2的表達(dá)水平主要通過上調(diào)METTL3而增強(qiáng)?？紤]到HDGF可以在細(xì)胞核中定位并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，我們研究了HDGF是否可以轉(zhuǎn)錄激活GLUT4和ENO2的表達(dá)。通過ChIP分析發(fā)現(xiàn)，HDGF直接與GLUT4和ENO2的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，而與HK2的啟動(dòng)子區(qū)不結(jié)合（圖7H）。IHC結(jié)果顯示，METTL3過表達(dá)導(dǎo)致AGS腫瘤異種移植中HDGF、GLUT4和ENO2染色明顯增加，而當(dāng)HDGF敲除時(shí)，GLUT4和ENO2表達(dá)明顯下降（圖7I）。同樣，在缺乏METTL3的NCI-N87腫瘤異種移植中，HDGF、GLUT4和ENO2染色明顯下降（圖7J）?？傊@些結(jié)果表明METTL3/HDGF通過糖酵解途徑促進(jìn)胃癌的發(fā)生和肝轉(zhuǎn)移。
   為了研究METTL3 / GC HDGF軸在促進(jìn)糖酵解和血管生成中的臨床意義，我們檢查METTL3，HDGF，GLUT4，ENO2和CD31在GC患者癌組織中的表達(dá)。54例胃癌患者中METTL3表達(dá)與HDGF、CD31、GLUT4、ENO2表達(dá)呈正相關(guān)（圖8A，B）。

結(jié)論：
   我們的發(fā)現(xiàn)揭示了METTL3在胃癌發(fā)生發(fā)展中的致癌作用。機(jī)制上，METTL3/ HDGF/GLUT4/ENO2軸通過增加糖酵解和血管生成來促進(jìn)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。另外，METTL3在胃癌中的表達(dá)明顯增加，與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)。因此，METTL3可能是胃癌潛在的預(yù)測(cè)和治療靶點(diǎn)。