METTL3介導的HDGF mRNA m6A修飾促進胃癌進展

   m6A甲基化被認為是真核mRNA中最豐富、最普遍的修飾。m6A修飾的作用包括調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、剪切、轉(zhuǎn)運、定位和翻譯和RNA蛋白質(zhì)交互。在過去的幾年中，m6A調(diào)節(jié)因子的生物學功能被報道與干細胞分化、組織發(fā)育、晝夜節(jié)律周期和腫瘤進展相關(guān)。然而，m6A的生物學意義以及其在人類胃癌（GC）中的潛在調(diào)控機制仍不清楚。那么小編為大家介紹一篇最近發(fā)表在期刊Gut上的文章：“METTL3-mediated m6A modification of HDGF mRNA romotes gastric cancer progression and has rognostic significance”。在本研究中，我們揭示了METTL3介導的m6A修飾在GC中的生物學作用，并提出METTL3可能是一種新的預測GC進展的生物標志物和治療靶點。

結(jié)果：
1.METTL3表達升高與胃癌患者預后不良相關(guān)
   為了闡明m6A修飾在胃癌中的功能作用，我們首先檢測了28個胃癌組織和正常胃粘膜的m6A RNA水平。通過dot blot和ELISA檢測，我們發(fā)現(xiàn)GC組織中的m6A RNA水平明顯升高（圖1A，1B）。其中甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在GC中顯著上調(diào)（圖1C，1D）。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，METTL3 mRNA水平升高的GC患者總體生存較差（圖1E）。與上述結(jié)果一致，經(jīng)western blot檢測發(fā)現(xiàn)，86%人胃癌組織中METTL3蛋白水平明顯高于正常胃組織（圖1F）。這些結(jié)果在胃癌組織芯片中得到證實，經(jīng)免疫組化染色顯示，胃癌組織中METTL3的表達較正常胃組織明顯增加（圖1 G，H）。此外，METTL3表達增高的胃癌患者5年總生存期較差（圖I）。多元回歸分析表明，METTL3是一個獨立的預測患者的預后的標志GC（圖1 J）。為了進一步評估METTL3表達的預測能力，我們進行了時間依賴的接受者操作特征曲線分析，結(jié)果顯示，臨床風險評分(TNM期)和METTL3風險評分的聯(lián)合作用遠遠大于單獨的GC隊列中的任何一個（圖1K）。綜上所述，m6A修飾和METTL3水平在GC中有所升高，METTL3可能是胃癌患者的獨立預后因素。

2.p300介導的H3K27ac激活GC中METTL3的轉(zhuǎn)錄
   為了探索METTL3在GC中的高表達機制，我們首先通過UCSC基因組生物信息學位點分析了METTL3啟動子的修飾。如圖2A所示，在METTL3的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)大量的H3K27乙?；℉3K27ac）信號，提示METTL3可能受染色質(zhì)乙?；{(diào)控。然后，我們用靶向P300的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑C646處理HGC-27細胞，結(jié)果顯示METTL3表達明顯下降，呈時間和劑量依賴性，HGC-27細胞未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性（圖2B-D）。使用western blot檢測，我們發(fā)現(xiàn)C646處理后H3K27ac和METTL3蛋白水平下降（圖2E）。接下來，我們使用特定的siRNAs敲除P300（圖2F），發(fā)現(xiàn)P300的敲除顯著降低了METTL3的mRNA和蛋白水平（圖2G，H）。此外，染色質(zhì)免疫沉淀實驗結(jié)果表明，METTL3的啟動子區(qū)域在P300結(jié)合和H3K27ac信號中富集，P300的敲除可以顯著降低METTL3啟動子中H3K27ac信號的富集（圖2I，J）。這些數(shù)據(jù)證實，p300介導的METTL3啟動子H3K27ac活化可能是METTL3上調(diào)的部分原因（圖2K）。

3.METTL3促進GC增殖和血管生成
   為了研究METTL3在GC中的作用，我們建立了穩(wěn)定的過表達METTL3的GC細胞（圖3A）。METTL3的上調(diào)顯著提高了GC細胞軟瓊脂菌落形成效率(圖3B)和克隆能力（圖3C）。我們還檢測METTL3提升GC細胞增殖是否依賴于其m6A催化活性。與野生型細胞相比，催化突變的METTL3能顯著降低BGC823細胞的m6A水平（圖3D）。此外，METTL3的m6A催化活性對于促進BGC823細胞的克隆能力是必不可少的（圖3E）。我們還建立了穩(wěn)定的METTL3敲除的GC細胞。在METTL3敲除或敲除后，m6A水平顯著降低（圖3F）。敲除METTL3明顯抑制軟瓊脂菌落形成效率和克隆能力（圖3G，H）。另外，過表達METTL3大大促進腫瘤生長（圖3 I-K）。IHC結(jié)果顯示與對照相比，METTL3過表達組的腫瘤組織增加（圖3L）。為了進一步研究METTL3在胃癌血管生成中的作用，我們在體外研究了人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的生長和成管過程。過表達METTL3的BGC823細胞的條件培養(yǎng)基顯著增加了管的形成和HUVEC生長（圖3M）。我們還建立了3例不同類型的胃癌患者的器官樣體模型，進一步驗證METTL3的潛在臨床價值。結(jié)果表明，慢病毒過表達METTL3可顯著促進三種不同類型GC器官中GC細胞的增殖（圖3N）。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3可能是一種致癌基因，其m6A催化活性可促進胃癌的增殖和血管生成。

4.METTL3促進胃癌的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移
   為了確定METTL3在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用，我們首先在體外進行了遷移和侵襲實驗。數(shù)據(jù)顯示METTL3的異位表達促進了BGC823和AGS細胞的遷移和侵襲（圖4A，B）。然而，在HGC-27和NCI-N87細胞中，METTL3敲除產(chǎn)生相反的作用（圖4C）。我們進一步評估了METTL3對胃癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。通過裸小鼠脾靜脈注射過表達METTL3的BGC823 -熒光素酶細胞及相應的對照細胞。8周后，METTL3的上調(diào)明顯促進了GC肝轉(zhuǎn)移，生物熒光成像顯示，與對照組相比，METTL3的上調(diào)明顯促進了GC肝轉(zhuǎn)移（圖4D-F）。相比之下，METTL3缺乏的NCI-N87細胞顯著抑制了GC肝轉(zhuǎn)移（圖4G，H）?？傊?，這些結(jié)果表明METTL3在促進胃癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用。

5.METTL3介導的HDGF mRNA m6A修飾維持了其依賴IGF2BP3的穩(wěn)定性
   為了明確METTL3促進胃癌進展的分子機制，我們對METTL3過表達和敲除的GC細胞進行RNA測序，并對METTL3過表達的GC細胞和對照細胞進行m6A修飾的RNA免疫沉淀測序（圖5A）。通過分析和細胞實驗確定了HDGF mRNA m6A修飾（圖5B-G）。METTL3過表達的免疫純化RNA中AGACC motif高度富集（圖5H）， METTL3上調(diào)時HDGF mRNA中的m6A豐度顯著增加（圖5I）。另外，m6A特異性抗體顯著富集了METTL3過表達的HDGF mRNA，而m6A特異性抗體顯著降低METTL3敲除對HDGF mRNA的富集（圖5J）?？紤]到m6A修飾對HDGF的mRNA水平具有正向調(diào)節(jié)作用，我們進而研究m6A修飾是否影響HDGF mRNA的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，METTL3過表達時HDGF mRNA水平高度穩(wěn)定，敲除METTL3則相反（圖5K）。此外，據(jù)報道HDGF是IGF2BP1/2/3的高通量測序結(jié)果的靶標之一。因此，我們探討了IGF2BP1/2/3對HDGF mRNA穩(wěn)定的影響。其中只有IGF2BP3的下調(diào)顯著抑制HDGF mRNA的表達（圖5L）。與IgG對照抗體相比，IGF2BP3特異性抗體在RIP-qPCR檢測中顯著富集HDGF mRNA（圖5K）。接下來，我們比較了28個GC組織和TCGA數(shù)據(jù)中HDGF和IGF2BP3的mRNA水平。結(jié)果顯示，與正常胃組織相比，胃癌組織中HDGF和IGF2BP3的表達顯著上調(diào)（圖5N-Q）。我們還發(fā)現(xiàn)METTL3和IGF2BP3的表達與HDGF的表達顯著相關(guān)（圖5R，S）。我們也進行腫瘤異種移植研究。結(jié)果表明，敲低METTL3、HDGF和IGF2BP3可顯著抑制腫瘤生長（圖5T-V）。

6.METTL3通過上調(diào)HDGF表達來加速GC惡性過程
   為了進一步表征HDGF在GC中的致癌功能，我們設(shè)計了三種不同的針對HDGF的siRNAs，并通過qRT-PCR和western blotting證實了它們的敲除效率（圖6A）。HDGF的下調(diào)顯著抑制了菌落形成、細胞遷移和侵襲以及HUVEC的生長和成管（圖6B-D）。此外，HDGF重組蛋白挽救了METTL3敲除GC細胞的集落形成能力（圖6E）。與預期一樣，在METTL3過表達的AGS細胞中，HDGF的表達被其特異性的siRNAs敲除，從而顯著抑制了METTL3誘導的GC細胞遷移和侵襲（圖6F）。此外，HDGF的敲低明顯抑制METTL3誘導的 GC體內(nèi)生長和血管生成（圖6G-J）。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，METTL3通過上調(diào)HDGF表達來促進GC惡性進展。

7.METTL3通過HDGF激活的GLUT4和ENO2的表達來促進GC中的糖酵解
   我們研究METTL3是否調(diào)節(jié)糖酵解促進GC惡性過程。如圖7A，B所示，上調(diào)BGC823細胞中METTL3的表達可顯著增加葡萄糖攝取和乳酸的產(chǎn)生。為了研究HDGF是否能恢復METTL3敲除細胞的糖酵解活性，我們將HDGF過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到METTL3敲除細胞中。結(jié)果表明HDGF過表達可恢復METTL3敲除GC細胞的糖酵解活性，并顯著增加乳酸產(chǎn)量（圖7C）。細胞外酸化速率動力學曲線進一步表明，過表達METTL3的BGC823細胞的糖酵解活性顯著增加，而敲除METTL3的HGC-27細胞的糖酵解活性下降（圖7D，E）。為了進一步研究METTL3調(diào)控糖酵解的機制，我們檢測了METTL3過表達和METTL3敲除的GC細胞中與葡萄糖代謝相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄（圖7F）。我們還檢測了這些基因是否受HDGF調(diào)控，并檢測了HDGF敲低GC細胞中與葡萄糖代謝相關(guān)的基因（圖7G）。發(fā)現(xiàn)只有GLUT4和ENO2的表達水平主要通過上調(diào)METTL3而增強?？紤]到HDGF可以在細胞核中定位并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，我們研究了HDGF是否可以轉(zhuǎn)錄激活GLUT4和ENO2的表達。通過ChIP分析發(fā)現(xiàn)，HDGF直接與GLUT4和ENO2的啟動子區(qū)結(jié)合，而與HK2的啟動子區(qū)不結(jié)合（圖7H）。IHC結(jié)果顯示，METTL3過表達導致AGS腫瘤異種移植中HDGF、GLUT4和ENO2染色明顯增加，而當HDGF敲除時，GLUT4和ENO2表達明顯下降（圖7I）。同樣，在缺乏METTL3的NCI-N87腫瘤異種移植中，HDGF、GLUT4和ENO2染色明顯下降（圖7J）。總之，這些結(jié)果表明METTL3/HDGF通過糖酵解途徑促進胃癌的發(fā)生和肝轉(zhuǎn)移。
   為了研究METTL3 / GC HDGF軸在促進糖酵解和血管生成中的臨床意義，我們檢查METTL3，HDGF，GLUT4，ENO2和CD31在GC患者癌組織中的表達。54例胃癌患者中METTL3表達與HDGF、CD31、GLUT4、ENO2表達呈正相關(guān)（圖8A，B）。

結(jié)論：
   我們的發(fā)現(xiàn)揭示了METTL3在胃癌發(fā)生發(fā)展中的致癌作用。機制上，METTL3/ HDGF/GLUT4/ENO2軸通過增加糖酵解和血管生成來促進胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。另外，METTL3在胃癌中的表達明顯增加，與胃癌患者預后不良有關(guān)。因此，METTL3可能是胃癌潛在的預測和治療靶點。