細(xì)胞核內(nèi)含物加載到外泌體的機(jī)制

   外泌體物質(zhì)種類繁多，包括蛋白質(zhì)、小RNA和基因組DNA(GDNA)。gDNA的存在表明不同的細(xì)胞內(nèi)隔室有助于外泌體的裝載，導(dǎo)致不同的外泌體亞群。然而，對(duì)gDNA和其他核內(nèi)容進(jìn)入外泌體(Nexo)的了解仍然很少。
   近期，一篇名為“Mechanisms of nuclear content loading to exosomes”的文章在《Science Advances》上發(fā)表。

   文章所述研究確定了作為基因組不穩(wěn)定性標(biāo)記的癌細(xì)胞微核(MN)與Nexo形成之間的關(guān)系。成像流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，10%的來(lái)自癌細(xì)胞的外泌體和<1%的來(lái)自卵巢癌患者血液和腹水的外泌體含有核內(nèi)容物。在體外和體內(nèi)用基因毒性藥物治療導(dǎo)致MN和Nexos增加。觀察到多泡體前體和外泌體標(biāo)記物，如Tetraspanins，直接與MN相互作用。總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)工作提供了與Nexos相關(guān)的新見解，這對(duì)癌癥生物標(biāo)記物的開發(fā)具有影響。
技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.卵巢癌外泌體含有細(xì)胞核內(nèi)含物
   篩選了癌癥基因組圖譜(TCGA)，以確定哪些腫瘤類型具有最高數(shù)量的染色體重復(fù)，是最不穩(wěn)定的(圖1A)。在所研究的25種腫瘤類型中，觀察到高級(jí)別漿液性卵巢癌(HGSC)在中位倍體中排名第四，基因組高度不穩(wěn)定，這與不良的臨床結(jié)果相關(guān)。使用HGSC臨床前模型，用低溫電子顯微鏡(Cryo-EM)、納米顆粒跟蹤分析(NTA)和免疫印跡分析(圖1，B到D)檢測(cè)分離的外泌體的純度。為了確定外泌體是否攜帶核蛋白，對(duì)外泌體組分進(jìn)行了質(zhì)譜(MS)分析。在從OVCAR-5(OVCAR-5exo)細(xì)胞分離的外泌體中，檢測(cè)到一個(gè)201個(gè)核相關(guān)蛋白和17個(gè)染色體相關(guān)蛋白的HGSC細(xì)胞系，其中12.5%的被檢測(cè)蛋白是核來(lái)源的(圖1，E和F)。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，使用全基因組測(cè)序(WGS)來(lái)比較來(lái)自O(shè)VCAR-5細(xì)胞和外泌體的DNA之間的CNVs(圖1G)。細(xì)胞和外泌體DNA之間的CNVs非常相似(圖1H)。雖然一些研究表明gDNA存在于外泌體中，但包含DNA的外泌體的亞群和包含DNA的外泌體的數(shù)量尚不清楚為了解決這個(gè)問(wèn)題，使用Amnis Image Stream X，MkII流式細(xì)胞儀檢測(cè)如前所述的單個(gè)外泌體。采用這種方法分析Nexo，首先用CellMask質(zhì)膜染色法對(duì)外泌體進(jìn)行染色，然后加載到流動(dòng)分析儀上。不同大小的珠子被用作設(shè)置外泌體種群的門的參考(圖1I)。為了鑒定gDNA的存在并量化DNA陽(yáng)性外泌體的百分比，用DRAQ5對(duì)外泌體進(jìn)行染色，DRAQ5是一種優(yōu)先結(jié)合雙鏈DNA(dsDNA)，浸透細(xì)胞以允許量化DNA陽(yáng)性外泌體的百分比(圖1I)。此外，單粒子成像流式細(xì)胞術(shù)方法允許對(duì)DNA陽(yáng)性外泌體的亞群進(jìn)行定量，這些外泌體也對(duì)其他外體蛋白標(biāo)記呈陽(yáng)性，如tetraspanins(圖1I)。除了gDNA外，還檢測(cè)了外泌體中Lamin A/C的存在，Lamin A/C是一種核膜蛋白，存在于我們的OVCAR5-exo MS數(shù)據(jù)中(圖1，E和F)。觀察到Lamin A/C也可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到(圖1J)。與gDNA相反，Lamin A/C在OVACR5-exo中沒(méi)有那么豐富，但確實(shí)觀察到超過(guò)50%的DNA陽(yáng)性外泌體也對(duì)Lamin A/C呈陽(yáng)性(圖1J)。

圖一 卵巢癌外泌體核源性內(nèi)含物的鑒定（D）TSG101、Alix和CD63用作外泌體標(biāo)記，GRP94用作細(xì)胞污染的標(biāo)記。Tcl，細(xì)胞總裂解物。（E）核成分以紅色突出顯示：1，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；2，內(nèi)體；3，高爾基體；4，細(xì)胞表面；5，線粒體；6，蛋白酶體；7，液泡；8，剪接小體復(fù)合體。（F）x軸表示蜂窩室的類別。在染色體和細(xì)胞核中鑒定的核蛋白以紅色突出顯示。（G）外泌體DNA(內(nèi)紅圈)，細(xì)胞DNA(外藍(lán)圈。最外面的圓圈用坐標(biāo)表示人類染色體(兆基)。藍(lán)色和紅色內(nèi)圓內(nèi)的綠色和紅色直方圖表示由cnvkit識(shí)別的拷貝數(shù)改變。軌道上的條形越大，拷貝數(shù)改變(對(duì)數(shù)刻度)越大。綠色條表示放大事件，紅色條表示刪除（I）左上：粒子顯示為黑點(diǎn)，外泌體位于綠色區(qū)域。右圖：每個(gè)點(diǎn)表示用CellMask Green(Ch02)染色的單個(gè)外泌體，紅色的框表示用DRAQ5(Ch11)染色的DNA陽(yáng)性顆粒。左下角：?jiǎn)为?dú)染色的外泌體的快照。(A)和(B)是存在于右圖所示區(qū)域的外泌體。(A)代表DNA陽(yáng)性的外泌體，(B)代表陰性的外泌體。（J）左圖：每個(gè)綠點(diǎn)表示單個(gè)外泌體，藍(lán)色框表示Lamin A/C陽(yáng)性群體。右圖：所有的點(diǎn)都來(lái)自DNA陽(yáng)性的外泌體，綠色框表示Lamin A/C陽(yáng)性的群體。

2.MN的誘導(dǎo)增加了攜帶DNA的外泌體的數(shù)量
   類似于gDNA在癌源外泌體中的存在，MN也由于其固有的基因組不穩(wěn)定性而在癌細(xì)胞中更為普遍?；谶@一想法，調(diào)查MN的存在與nExo之間是否存在任何關(guān)系。首先確定了原代健康輸卵管上皮細(xì)胞(FTE)中含有MN的細(xì)胞的基線數(shù)量，并與卵巢癌細(xì)胞系進(jìn)行了比較。在原代FTE細(xì)胞中，被認(rèn)為是許多HGSC的起源細(xì)胞，含有MN的細(xì)胞的盛行率為1%(圖2，A和B)。相反，大約4%的卵巢癌細(xì)胞含有MN(圖2，A和B)。比較健康細(xì)胞和癌細(xì)胞分泌的Nexo的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞分泌的Nexo群體明顯更高(FTEexo，0.12±0.04%；OVCAR-5exo，8.26±1.62%；和OVCAR-8exo，8.25±2.61%)(圖2，C和D)。這些數(shù)據(jù)表明，具有高度基因組不穩(wěn)定性從而增加MN的細(xì)胞，如癌細(xì)胞，分泌更多數(shù)量的Nexos。為了進(jìn)一步驗(yàn)證假設(shè)，用基因毒性藥物topotecan(10 NM)或olaparib(20μM)處理卵巢癌細(xì)胞，以誘導(dǎo)MN的形成。無(wú)論使用哪一種藥物治療后，MN的數(shù)量顯著增加(圖2，E和F)。類似地，含有g(shù)DNA的外泌體(圖2，G和H)的數(shù)量在用這些藥物治療后也增加了。這些結(jié)果表明，誘導(dǎo)基因組不穩(wěn)定性增加了MN產(chǎn)量，從而增加了Nexo豐度。

圖二 促進(jìn)MN的形成增加了攜帶DNA的外泌體。（A）插圖顯示右側(cè)面板中微核OVCAR-5細(xì)胞的放大圖像。（C）兩個(gè)圖中的框都表示DNA陽(yáng)性群體。（D）FTEexo，OVCAR-5exo和OVCAR-8exo中DNA陽(yáng)性外泌體群體。（E）用Lamin A/C抗體對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行IF染色。（H）用DMSO，olaparib或topotecan處理親代細(xì)胞48小時(shí)。FTEexo、OVCAR-5exo和OVCAR-8exo分別表示來(lái)自FTE、OVCAR-5和OVCAR-8細(xì)胞的外泌體。
   為了在體內(nèi)驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，使用代表播散性腹膜疾病的OVCAR-5卵巢癌模型。如示意圖(圖3A)所示，每只荷瘤小鼠均接受最大耐受量的拓?fù)涮婵?7.5 mg/kg)治療，48小時(shí)后euthanasia。每只小鼠的腫瘤生長(zhǎng)通過(guò)體內(nèi)成像得到確認(rèn)(圖3B)。為了確定拓?fù)涮婵凳欠窨梢哉T導(dǎo)MN的形成，正如、體外觀察的那樣，收集腫瘤結(jié)節(jié)，切片，用H&E染色，通過(guò)強(qiáng)光和免疫熒光(IF)顯微鏡進(jìn)行檢查(圖3，C和D)。H&E染色證實(shí)拓?fù)涮婵堤幚砗驧N的存在(圖3C)。為計(jì)算MN的數(shù)量，多次拍攝腫瘤切片的IF圖像，并且通過(guò)Vectra-Inform圖像分析系統(tǒng)(PerkinElmer)系統(tǒng)地計(jì)數(shù)MN(圖3D)。拓?fù)涮婵抵委熃M與賦形劑對(duì)照組相比，有增加MN陽(yáng)性細(xì)胞百分比的趨勢(shì)，盡管這個(gè)百分比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性(圖3E)。為了測(cè)量每次治療后Nexos產(chǎn)生量的差異，從各組荷瘤小鼠的血清和腹水中分離外泌體，通過(guò)冷凍-EM、NTA和CD63的Western blotting(圖3，F(xiàn)至H)確認(rèn)它們的純度，并通過(guò)成像流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量。荷瘤小鼠的血清中通常比非帶瘤小鼠有更多的Nexos(P=0.008)(圖3I)。將拓?fù)涮婵抵委煹男∈笈c賦形劑對(duì)照組相比，我們觀察到腹水中Nexos的顯著增加(P=0.028)，但血清Nexos沒(méi)有差異(圖3，J和K)。這些結(jié)果表明，腫瘤產(chǎn)生更多的Nexo，遺傳毒性藥物促進(jìn)體內(nèi)MN的形成，增加Nexo的釋放量。

圖三 基因毒性藥物在卵巢癌中對(duì)Nexos的體內(nèi)促進(jìn)作用。（C）黑色箭頭表示MN。（D）左上圖：DAPI和Palloidin染色的腫瘤組織的代表性圖像。右上圖：使用VECTRA成像軟件進(jìn)行細(xì)胞分割的代表性圖像。下圖：檢測(cè)到的MN的代表性圖像，由白色箭頭指示。

3.MN和nExo在活細(xì)胞中共享內(nèi)含物并相互作用
   接下來(lái)，比較MN和Nexos之間的相對(duì)核蛋白豐度。通過(guò)蔗糖梯度超速離心法分離OVCAR-5細(xì)胞中的MN，富集MN的組分洗滌并提交MS(圖4A)。用4‘，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和IF(圖4A)確認(rèn)MN富集。MN組分的MS分析顯示OVCAR-5 MN和nExo蛋白含量之間有很大的相似性，兩個(gè)細(xì)胞隔室之間有127個(gè)蛋白質(zhì)重疊(圖4，B和C)。這些共享的核蛋白包括Lamin A/C和組蛋白H2B以及一些外泌體標(biāo)記，如熱休克蛋白(圖4C)。接下來(lái)，確定MN和外泌體相關(guān)蛋白是否在細(xì)胞內(nèi)相互作用。外泌體標(biāo)記如CD63，CD9和CD81的共聚焦成像顯示這些蛋白質(zhì)在卵巢癌細(xì)胞的核膜或MN內(nèi)共定位(圖4，D和E，以及圖S4A)。為了進(jìn)一步探討這種相互作用是否發(fā)生在活細(xì)胞中，對(duì)過(guò)表達(dá)熒光標(biāo)記的細(xì)胞的核蛋白和tetraspanins進(jìn)行了延時(shí)成像。CD9和CD63都與OVCAR-5細(xì)胞中和MN積極相互作用(圖4，F(xiàn)和G)。這些發(fā)現(xiàn)表明，MN和Nexos都有很高的核含量，并且這些結(jié)構(gòu)在活細(xì)胞內(nèi)積極地相互作用。

圖四 MN和nExo含有相似的蛋白質(zhì)內(nèi)含物。（A）所有標(biāo)本均取自O(shè)VCAR-5細(xì)胞，DAPI染色。中間圖像中的白色框是放大的視圖。（B）樣品取自O(shè)VCAR-5細(xì)胞。x軸表示單元組件的類別。來(lái)自細(xì)胞核和染色體隔間的蛋白質(zhì)以黃色突出顯示。（C）樣品取自O(shè)VCAR-5細(xì)胞。重疊的127個(gè)蛋白中包括Lamin A/C、組蛋白H2A/B、Importin和熱休克蛋白(HSP)70/90。（D和E）mCherry-lamina/C-表達(dá)OVCAR-5細(xì)胞的連續(xù)共聚焦圖像。DAPI染色細(xì)胞核。CD63和CD9用抗體IF染色。（F）細(xì)胞膜用CellMask深紅染色。通過(guò)慢病毒感染細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)-CD63。（G）用mEmerald-CD9質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

4.破碎MN物質(zhì)被裝載到外泌體中
   已知MN的包膜是不穩(wěn)定的，當(dāng)其崩潰時(shí)，包括gDNA在內(nèi)的MN內(nèi)含物暴露在細(xì)胞質(zhì)中。因此，探究這種塌陷是否可以誘導(dǎo)MN內(nèi)容加載到外泌體中。與先前的發(fā)現(xiàn)一致，卵巢癌細(xì)胞的共聚焦成像顯示一些MN沒(méi)有被它們的核膜包圍，表明MN塌陷(圖5，A和B)。觀察到可以作為MVBs標(biāo)記物的Tetraspanin蛋白經(jīng)常以部分或全部核膜塌陷包圍MN(圖5，A和B)。這些結(jié)果通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)得到了驗(yàn)證(圖5，C至E)。這表明，與共聚焦觀察相似，卵巢癌細(xì)胞含有塌陷的MN(圖5C)。為了解決核內(nèi)含物加載到外泌體背后的機(jī)制，假設(shè)塌陷的MN直接與外泌體生物合成的分子機(jī)制相互作用。外泌體最初由早期核內(nèi)體的腔內(nèi)囊泡形成，然后儲(chǔ)存在MVBs中。然后，通過(guò)MVBs與質(zhì)膜的融合，這些囊泡作為外泌體釋放到細(xì)胞外空間。TEM顯示MVBs位于MN和早期核內(nèi)體附近，因此可以直接與塌陷的MN相互作用(圖5，D和E)。此外，共聚焦分析顯示完整和塌陷的MN均對(duì)早期內(nèi)體標(biāo)志物EEA1呈陽(yáng)性(圖5F)。這些結(jié)果表明gDNA可以以外泌體依賴或非外泌體依賴性的方式分泌，其中塌陷的MN可以與早期的核內(nèi)體或自噬內(nèi)涵體相互作用。為了進(jìn)一步探索驅(qū)動(dòng)MN內(nèi)含物裝載到外泌體中的分子機(jī)制，重點(diǎn)研究了tetraspanins，如CD63，因?yàn)樗鼈儏⑴c外泌體/MVB物質(zhì)裝載。為了確定Tetraspanins對(duì)將MN內(nèi)含物裝載到核內(nèi)體并最終進(jìn)入nExos是否是必需的，用短發(fā)夾狀RNA(ShRNA)敲除了卵巢癌細(xì)胞系中的CD63。在確認(rèn)CD63蛋白敲除后(圖5G)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)nExos數(shù)量的變化。CD63敲低的細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞分泌更少的nExos(圖5H)，這表明CD63在向nExos中裝載核內(nèi)含物方面起著重要作用。為了進(jìn)一步探討CD63在nExo加載中的作用，進(jìn)行了免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)。來(lái)自O(shè)VCAR-5細(xì)胞裂解液的CD63pulldown揭示了與DNA和組蛋白H2B的聯(lián)系(圖5，I和J)。因此，CD63可以產(chǎn)生gDNA和核蛋白的復(fù)合物，并且可能對(duì)DNA在外泌體中的裝載起重要作用。

圖五 破碎MN貨物被裝載進(jìn)nExos。（B）細(xì)胞核用DAPI染色，Lamin A/C和CD9用抗體IF染色。（C至E）黑色箭頭表示MN的核包膜破裂。（F）IF用抗體進(jìn)行Lamin A/C和EEA1染色。（G）CTRL表示轉(zhuǎn)染了擾亂shRNA序列的OVCAR-5細(xì)胞。密度分析在柱狀圖中定量。（I）對(duì)CD63進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)的OVCAR-5細(xì)胞樣品用2%瓊脂糖凝膠電泳分析，并用溴化乙錠染色顯示DNA。（J）CTRL-IP表示用通用磁性Co-IP試劑盒中的陰性對(duì)照免疫球蛋白G(Ig G)處理的OVCAR-5細(xì)胞(54002，活性基序)。

5.臨床標(biāo)本中nExo的檢測(cè)
   為了探討Nexo的臨床相關(guān)性，從HGSC患者的血漿和腹水中分離出外泌體，以表征它們的外泌體內(nèi)含物(圖6，A和B)。由于超速離心分離的人血清外切體中存在豐富的免疫球蛋白污染，采用尺寸排阻色譜對(duì)這些外泌體進(jìn)行純化，然后進(jìn)行MS蛋白質(zhì)組分析。MS分析表明，在患者來(lái)源的外泌體中鑒定的總蛋白中，3.2%至3.6%是核蛋白(圖6，C和D)。在人類腫瘤組織中也檢測(cè)到MN，分析的每個(gè)腫瘤中微核細(xì)胞的患病率為1%(圖6，E和F)。使用流式細(xì)胞術(shù)，<1%的外泌體含有g(shù)DNA，這與我們的活體小鼠模型數(shù)據(jù)一致(圖3I)。對(duì)晚期HGSC患者樣本的WGS分析顯示，在腹水來(lái)源的腫瘤和nExos中都發(fā)現(xiàn)了43個(gè)基因突變。這些突變的基因中有幾個(gè)參與DNA修復(fù)，例如DROSHA，LIG4，MACROD2，SATB1，RASSF6和BIRC2(圖6H)。此外，根據(jù)讀取計(jì)數(shù)的結(jié)果，外泌體中的絕大多數(shù)DNA起源于基因組而不是線粒體，并且突變特征相似(圖6I)。此外，腹水外泌體具有與原發(fā)腫瘤相似的CNV，但血漿外泌體沒(méi)有(圖6J)。

圖六 臨床標(biāo)本中nExo 的檢測(cè)。（C和D）核組分以紅色高亮顯示。(C)“其他”包括細(xì)胞骨架、線粒體、核糖體和液泡。(D)“其他”包括線粒體、細(xì)胞核、細(xì)胞器腔、核糖體和液泡。（E）黑色箭頭表示MN。（F）每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)用于分析的視圖。n=4。（H）樣品取自HGSC患者。43個(gè)重疊基因中包括DROSHA、LIG4、MACROD2、SATB1、RASSF6和BIRC2。（I）所有三例患者均為晚期HGSC患者。（J）概況顯示體細(xì)胞染色體獲得(上)和丟失(下)，以及正常的多態(tài)性。