Kindlin-2通過促進(jìn)MOB1的降解來抑制Hippo信號(hào)通路

   Hippo信號(hào)通路在發(fā)育和癌癥進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。然而，本質(zhì)上抑制這種途徑的分子還不太為人所知?！癒indlin-2 Inhibits the Hippo Signaling Pathway by Promoting Degradation of MOB1”一文研究報(bào)道了黏著斑分子Kindlin-2通過與MOB1相互作用并降解MOB1和促進(jìn)MOB 1與E3連接酶praja2之間的相互作用來抑制希波信號(hào)傳導(dǎo)。Kindlin-2因此抑制LATS1和YAP的磷酸化，并促進(jìn)YAP轉(zhuǎn)位入核，在核中激活下游Hippo靶基因轉(zhuǎn)錄。Kindlin-2缺失激活Hippo/YAP信號(hào)并減輕單側(cè)輸尿管梗阻的Kindlin-2敲除小鼠的腎纖維化(單側(cè)輸尿管阻塞)。而且，腎纖維化患者樣本中Kindlin-2水平與MOB1和磷酸化YAP呈負(fù)相關(guān)。

文章亮點(diǎn):

1.Kindlin-2通過其E3連接酶praja2介導(dǎo)MOB1蛋白酶體降解
2.Kindlin-2通過促進(jìn)MOB1的降解抑制YAP的磷酸化
3.Kindlin-2耗竭激活Hippo途徑，減輕單側(cè)輸尿管阻塞誘導(dǎo)的腎纖維化
4.長效Kindlin-2 siRNA對(duì)單側(cè)輸尿管阻塞誘導(dǎo)的腎纖維化具有治療價(jià)值

圖形摘要:

結(jié)果:

一、Kindlin-2與MOB1相互作用并抑制Hippo信號(hào)通路的激活
   Kindlin-2在質(zhì)譜分析中被鑒定為與MOB相互作用，表明Kindlin-2參與了Hippo信號(hào)通路。此外，內(nèi)源性MOB1在HEK293T細(xì)胞中與Kindlin-2和FLAG-Kindlin-2共免疫沉淀(圖1A和1B)。相反，內(nèi)源性Kindlin-2在HEK293T細(xì)胞中被MOB1共免疫沉淀(圖1C)。這些結(jié)果表明Kindlin-2和MOB1在活細(xì)胞中相互作用。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)下拉結(jié)果顯示MOB1與Kindlin-2的氮端和中間區(qū)都有很強(qiáng)的相互作用，而與碳端的相互作用很弱。免疫熒光染色顯示Kindlin-2和MOB1共定位于HK2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖1d)。上述數(shù)據(jù)表明Kindlin-2直接與MOB1相互作用。接下來確定Kindlin-2和Hippo信號(hào)通路之間是否存在調(diào)節(jié)關(guān)系(圖1e和1F)。Kindlin-2過表達(dá)導(dǎo)致MOB1、pMOB-35、pLATS1-909和pYAP-127水平下降。然而，對(duì)經(jīng)前S1、經(jīng)前T1、經(jīng)后T1、經(jīng)前S1或經(jīng)后葉無明顯影響。Kindlin-2表達(dá)的減少導(dǎo)致MOB1、pMOB-35、pLATS1-909和pYAP-127水平的增加，這表明希波信號(hào)的激活，但是沒有觀察到對(duì)pMST1、MST1、LATS1或YAP的明顯影響(圖1E和1F)。此外，Kindlin-2過表達(dá)導(dǎo)致HKC和HEK293A細(xì)胞核中YAP水平升高，而Kindlin-2表達(dá)降低導(dǎo)致細(xì)胞核中YAP水平降低, 核中的YAP水平是根據(jù)Kindlin-2功能的獲得或喪失(圖1G)。qPCR顯示Kindlin-2過表達(dá)促進(jìn)CTGF和CYR61mRNA表達(dá)。相反，Kindlin-2的表達(dá)減少受到抑制CTGF和CYR61mRNA表達(dá)(圖1H)。因此，Kindlin-2抑制MOB1的表達(dá)和磷酸化。MOB1水平的降低會(huì)抑制LATS1的完全磷酸化；YAP的去磷酸化促進(jìn)其向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，在細(xì)胞核中它促進(jìn)下游靶CYR61和CTGF的轉(zhuǎn)錄。該機(jī)制在中建模圖1. 雖然Kindlin-2不影響YAP的水平，但Kindlin-2可能通過不同的上游機(jī)制調(diào)節(jié)Hippo/YAP信號(hào)通路。

                                                      圖1. Kindlin-2與MOB1相互作用并抑制Hippo(Hippo)通路的激活

二、Kindlin-2介導(dǎo)MOB1蛋白酶體降解
   Kindlin-2不影響MOB1HEK293T或HKC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄(圖2A和2B)。探討Kindlin-2介導(dǎo)MOB1降解的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)的FLAG-Kindlin-2以劑量依賴性方式顯著降低內(nèi)源性MOB1的蛋白水平(圖2C)。此外，Kindlin-2降低MOB1水平的作用通過用MG132蛋白酶體的抑制劑 (圖2D)，表明Kindlin-2對(duì)MOB1降解的影響是由蛋白酶體蛋白降解途徑介導(dǎo)的。使用Cycloheximide追蹤試驗(yàn)測量了Kindlin-2存在或不存在時(shí)MOB1的周轉(zhuǎn)率發(fā)現(xiàn)，與在HEK293T和HKC細(xì)胞中使用空載體相比，用Kindlin-2轉(zhuǎn)染導(dǎo)致內(nèi)源性MOB1的半衰期顯著減少(圖2E和2F)。與在HEK293T細(xì)胞中使用空載體時(shí)相比，用Kindlin-2小干擾核糖核酸 (siRNA) 轉(zhuǎn)染導(dǎo)致內(nèi)源性MOB1的半衰期顯著增加(圖2G和2H)。這些結(jié)果表明Kindlin-2通過蛋白酶體蛋白降解途徑介導(dǎo)MOB1降解。機(jī)制模型圖( 圖?2I).

                                                                圖2  Kindlin-2介導(dǎo)MOB1蛋白酶體降解

三、Kindlin-2通過增強(qiáng)MOB1與praja2的結(jié)合來介導(dǎo)MOB 1的降解
   Kindlin-2作為銜接蛋白不能直接降解MOB1。為了確定Kindlin-2是否通過praja2降解MOB1，發(fā)現(xiàn)praja2與FLAG-Kindlin-2共免疫沉淀(圖3A)和HEK293T細(xì)胞中內(nèi)源性Kindlin-2(圖3B)。為了確定Kindlin-2和praja2之間結(jié)合所涉及的蛋白質(zhì)區(qū)域，合成并表達(dá)了FLAG-praja-2的四個(gè)完整或截短版本:全長praja 2(aa 1–708)、aa 1–530區(qū)域、aa 531–708區(qū)域或aa 1–630區(qū)域(圖3C)，外源表達(dá)的GFP-Kindlin-2與全長FLAG-praja2(1–708)和aa 1–530區(qū)(圖3D)。此外，雙重免疫染色顯示Kindlin-2和praja2共定位于HK2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)(圖3E)。兩步共免疫沉淀(coIP)分析，確定Kindlin-2、MOB1和praja2三種分子形成復(fù)合物(圖3F)。Kindlin-2過表達(dá)增加了HEK293T細(xì)胞中MOB1與抗praja2抗體共免疫沉淀的量，而Kindlin-2缺失顯示了相反的作用(圖3G和3H)。Kindlin-2的過表達(dá)降低了pYAP、MOB1和pMOB1的水平，而Kindlin-2的過表達(dá)和praja2的同時(shí)缺失部分挽救了pYAP、MOB1和pMOB1的水平(圖3I)。Kindlin-2通過praja2介導(dǎo)的腎細(xì)胞MOB1降解下調(diào)YAP磷酸化。這些結(jié)果表明Kindlin-2構(gòu)成了praja2和MOB1之間的橋梁，增強(qiáng)了它們的相互作用，促進(jìn)了MOB1的降解；模型圖(圖3J).

                                                                圖3  Kindlin-2增強(qiáng)MOB1和praja2之間的相互作用

四、Kindlin-2缺失激活單側(cè)輸尿管阻塞誘導(dǎo)Kindlin-2敲除小鼠腎纖維化中的Hippo信號(hào)
   由于Kindlin-2完全缺失的胚胎致死性，Kindlin-2敲除第一鼠標(biāo)模型只能獲得雜合子小鼠。基因型和Kindlin-2缺失效率被證實(shí)(圖4A—4D)。Kindlin-2水平在單側(cè)輸尿管阻塞之后顯著增加。此外，在單側(cè)輸尿管阻塞，Hippo信號(hào)通路與MST1、pMST1、pMOB1、LATS1、pLATS1、YAP和pYAP的上調(diào)和MOB1的下調(diào)一起被激活(圖4E和4F)。然而，Kindlin-2敲除小鼠中Kindlin-2的缺失導(dǎo)致了Hippo信號(hào)通路的更多磷酸化和激活(伴隨著pMOB1、pLATS1和pYAP的增加；p %3C 0.05)，比在單側(cè)輸尿管阻塞(圖4E和4F)。免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫熒光染色表明Kindlin-2的缺失激活了Hippo途徑，但不影響單側(cè)輸尿管阻塞(圖4G)。此外，與野生型單側(cè)輸尿管阻塞小鼠相比，Kindlin-2敲除單側(cè)輸尿管阻塞小鼠顯示腎纖維化標(biāo)志物α-SMA、纖連蛋白和間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白水平降低，但上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白水平升高。與對(duì)側(cè)相比，在野生型單側(cè)輸尿管阻塞小鼠中occludin和claudin-3明顯下調(diào)，而在Kindlin-2敲除單側(cè)輸尿管阻塞小鼠中，這種明顯的下調(diào)得到緩解。除了Hippo途徑，Wnt途徑在單側(cè)輸尿管阻塞之后被激活；而Kindlin-2敲除單側(cè)輸尿管阻塞小鼠與野生型單側(cè)輸尿管阻塞小鼠相比，其TCF4和β-連環(huán)蛋白水平降低(圖4E和4F)。Kindlin-2的過度表達(dá)導(dǎo)致了上皮鈣粘蛋白水平的降低，但是纖維連接蛋白、膠原蛋白ⅰ和α-形狀記憶合金(圖4H，左側(cè))。相反，Kindlin-2表達(dá)的減少恢復(fù)了這些標(biāo)記物的水平(圖4H，對(duì))。Kindlin-2 siRNA轉(zhuǎn)染后，我們在HKC細(xì)胞中過表達(dá)YAP。這些結(jié)果表明YAP的過度表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由Kindlin-2缺失引起的ⅰ型膠原和α-SMA的減少(圖4I)，提示Kindlin-2通過Hippo/YAP途徑促進(jìn)腎纖維化。這部分在中建模圖4J.

                                           圖4  Kindlin-2缺失激活Kindlin-2基因敲除小鼠單側(cè)輸尿管阻塞誘導(dǎo)的腎纖維化中的Hippo/YAP信號(hào)傳導(dǎo)

五、長期siRNA誘導(dǎo)Kindlin-2耗竭抑制單側(cè)輸尿管阻塞小鼠模型Hippo靶基因CTGF的上調(diào)
   在單側(cè)輸尿管阻塞小鼠模型中設(shè)計(jì)了兩個(gè)使用長效Kindlin-2 siRNAs的治療實(shí)驗(yàn)。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)，我們在單側(cè)輸尿管阻塞后7天以上給野生型小鼠施用了5 nmol長效Kindlin-2 siRNA或?qū)φ誷iRNA(圖5A).一般來說，晚期治療組(第5組)和陰性對(duì)照組(第6組)的腎體積大于早期治療組(第1-3組)。蛋白質(zhì)印跡顯示Kindlin-2被成功敲除，Kindlin-2的耗盡降低了CTGF和α-形狀記憶合金水平(圖5B和5C)。此外，形態(tài)學(xué)檢測顯示單側(cè)輸尿管阻塞腎臟(組1-5)比對(duì)照組(組6；圖5D)，表明用長效Kindlin-2 siRNA治療減輕了腎纖維化，早期治療產(chǎn)生了更好的結(jié)果。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，證明了5 nmol長效Kindlin-2 siRNA或?qū)φ誷iRNA對(duì)單側(cè)輸尿管阻塞后7天的野生型小鼠的作用(圖5E)。蛋白質(zhì)印跡顯示Kindlin-2被成功耗盡，Kindlin-2的低水平導(dǎo)致CTGF、纖連蛋白和α-形狀記憶合金的水平降低(圖5F)。形態(tài)學(xué)檢測顯示Kindlin-2 siRNA組的單側(cè)輸尿管阻塞腎纖維化癥狀比對(duì)照組siRNA較輕(圖5G)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，提出了一個(gè)工作模型，其中給予長效Kindlin-2 siRNAs通過三種主要的信號(hào)通路(圖5H)。

                                                  圖5  長效Kindlin-2 siRNA對(duì)單側(cè)輸尿管阻塞腎纖維化的治療作用

六、人腎纖維化標(biāo)本中Kindlin-2水平與MOB1和pYAP水平呈負(fù)相關(guān)
   與正常腎組織相比，腎纖維化組織中Kindlin-2、pYAP、YAP和CTGF水平較高，但MOB1水平較低(圖6A和6C)。這些觀察結(jié)果與單側(cè)輸尿管阻塞模型中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致(圖4E)。此外，發(fā)現(xiàn)腎纖維化患者腎小管中Kindlin-2水平與MOB1和pYAP水平呈負(fù)相關(guān)，總YAP水平無顯著變化(圖6B和6D)。在Kindlin-2水平較高的腎小管細(xì)胞核中檢測到的YAP水平高于Kindlin-2水平較低的細(xì)胞核(圖6B和6D)。這些數(shù)據(jù)支持Kindlin-2與MOB1和pYAP負(fù)相關(guān)，并促進(jìn)人腎纖維化中YAP的核轉(zhuǎn)位。對(duì)正常腎和腎透明細(xì)胞癌TCGA數(shù)據(jù)的分析揭示了以下基因表達(dá)的正相關(guān)性FERMT2和YAP下游基因CTGF和CYR61(圖6E–6H)。然而，在正常腎臟TCGA數(shù)據(jù)庫分析中，F(xiàn)ERMT2與YAP沒有關(guān)聯(lián)(圖6I)。相反，通過分析腎透明細(xì)胞癌TCGA數(shù)據(jù)庫，F(xiàn)ERMT2被發(fā)現(xiàn)與YAP有關(guān)(圖6J)。這些結(jié)果表明Kindlin-2在生理和病理?xiàng)l件下通過不同的分子機(jī)制調(diào)節(jié)Hippo/YAP信號(hào)通路。此外，Hippo/YAP的目標(biāo)基因，CTGF和CYR61，與FERMT2正相關(guān)在正常腎組織和腎透明細(xì)胞癌組織中。無論何種條件，Kindlin-2都能促進(jìn)YAP核轉(zhuǎn)位，上調(diào)Hippo靶基因。

                                                    圖6 Kindlin-2與人腎纖維化組織中Hippo/亞磷脂活化負(fù)相關(guān)
結(jié)論:
  表明Kindlin-2 通過MOB1的降解抑制Hippo信號(hào)傳導(dǎo)。針對(duì)Kindlin-2 的特定長效siRNA有效緩解了單側(cè)輸尿管阻塞誘導(dǎo)的腎纖維化，并可能成為腎纖維化的潛在療法。