lncRNA DRAIC治療前列腺癌的新靶點

   DRAIC是在抵抗性晚期前列腺癌中下調(diào)的1.7 kb的lncRNA。DRAIC表達的降低預(yù)示著前列腺癌和其他七種癌癥的患者預(yù)后不良，而DRAIC的升高則抑制了異種移植腫瘤的生長。在此背景下作者研究了lncRNA DRAIC前列腺癌中的功能與機制，并于2020年1月發(fā)表在Cancer Research（IF:8.378）上。
主要結(jié)果如下：
1、lncRNA DRAIC在體內(nèi)體外抑制腫瘤潛能
   如圖1，與對照（EV）相比，過表達lncRNA DRAIC（FL）顯著抑制了腫瘤的侵襲和增殖以及成瘤水平。

                                                                    圖1 lncRNA DRAIC在體內(nèi)體外抑制腫瘤潛能

2、前列腺癌中DRAIC的低表達與高活性的NF-κB有關(guān)
   GSEA分析顯示前列腺癌中TNFα-NF-κB被顯著激活（圖2A），TCGA顯示通過NF-κB 通路的TNFα信號的蛋白編碼基因與DRAIC表達呈負相關(guān)（圖2B），尤其是NF-κB通路的經(jīng)典蛋白（圖2C）。此外，DRAIC在IKK磷酸化IκBα中抑制NF-κB或其上游的活性（圖2D-G）。

                                                                圖2前列腺癌中DRAIC的低表達與高活性的NF-κB有關(guān)
   為了檢測DRAIC敲除后激活了哪一步，作者干擾了IκB激酶（IKK），NF-κB和IκBα的活性，如圖3A，然后檢測NF-κB的熒光素酶活性，如圖3B-G。結(jié)果表明DRAIC的敲低激活了IKK在IκBα磷酸化處或上游的NF-κB途徑。當過表達IKK（S177E / S181E）時，DRAIC過表達仍然抑制NF-κB活性（圖3H，與圖2E相比），這表明 DRAIC抑制了活性IKK下游的NF-κB通路。因此推斷，DRAIC可能通過干擾IKK的功能來抑制NF-κB途徑。

                                                                      圖3 DRAIC在 IKK水平抑制NF-κB通路
   與DRAIC干擾IKK活性的預(yù)期一致，敲除DRAIC增加了IκBα的活性，相反，TNFα刺激過表達DRAIC則抑制由TNFα刺激引起的IκBα活性（圖4A-C）。類似的，敲除DRAIC后降低了幾種內(nèi)源性的NF-κB響應(yīng)基因，如GSTP1，MCP-1，IL-6，IL-8和TNFα，同時增加了上述基因的啟動子綁定NF-κB（圖4D-E）。此外，由敲除DRAIC誘導的細胞侵襲在抑制NF-κB活性后下降了（圖4F-H）。以上說明，DRAIC介導的生物學功能改變是通過介導NF-κB通路活性實現(xiàn)的。

                                                                    圖4 DRAIC敲除增加了NF-κB通路的活性

3、使用CRISPR/Cas9敲除DRAIC外顯子2-4通過激活NF-κB增加腫瘤的侵襲
   雖然使用CRISPR/Cas9敲除DRAIC外顯子2-4后，DRAIC外顯子5的表達降低，細胞的增殖沒有改變，但是IκBα活性，IKK激酶的活性和NF-κB活性都顯著增加（圖5A-G）。此外，腫瘤細胞的侵襲和集落形成能力也都顯著提高（圖5H-K），相反的，侵襲和集落形成被外源性啟動子表達DRAIC抑制(圖5L-O)。類似的，腫瘤細胞的侵襲和集落形成能力同樣可以被NF-κB通路的IKK抑制劑BAY11-7082所抑制（圖5P-S）。此外，NF-κB通路響應(yīng)基因在敲除DRAIC后顯著上調(diào)表達。綜上結(jié)果表明，敲除DRAIC介導的細胞生物學功能改變是通過調(diào)控NF-κB活性實現(xiàn)的。

                                                        圖5 DRAIC敲除通過增加NF-κB通路的活性提高了前列腺癌的致瘤性

4、DRAIC與IKK復(fù)合物相互作用，降低了復(fù)合物的完整性
   RIP實驗證實DRAIC與IKKα，IKKβ和NEMO相互作用，而不與p65或IκBα作用。進一步的，siRNA介導敲除IKK復(fù)合物三個亞基中的兩個，然后對余下的亞基進行免疫沉淀，結(jié)果表明與DRAIC相關(guān)的所有三個亞基均獨立于其他亞基（圖6D）。之后，驗證DRAIC是否破壞了IKK復(fù)合物的完整性。DRAIC過表達，然后對NEMO（圖6E）或IKKα（圖6F）免疫沉淀，表明DRAIC降低了NEMO和IKKα的結(jié)合。

                                                                          圖6 DRAIC與IKK復(fù)合體相互作用

5、DRAIC外顯子4-5的701-905堿基抑制侵襲和NF-κB活性
   DRAIC中的缺失突變表明，與DRAIC KO中的IKKα免疫沉淀，含有外顯子4-5（堿基701-1705）但不包含外顯子1-3（堿基1-700）的片段與全長DRAIC的結(jié)果一樣好（圖7A）。當從外顯子4-5中以200個核苷酸的步長進行進一步刪除時，結(jié)果表明堿基701-905是與IKKα緊密相關(guān)的最小片段（圖7B）。有趣的是，當在DRAIC KO細胞中表達時，外顯子4-5（相對于外顯子1-3）和片段701-905（相對于900-1705）最能抑制NF-κB報告活性（圖7C-D）。此外，細胞侵襲和集落形成的能力也由DRAIC 701-905位點介導（圖7E-H），此外，細菌產(chǎn)生的重組IKKα或NEMO，在體外也由DRAIC（701-905）介導（圖7I）。不僅如此，體內(nèi)IKKα與NEMO結(jié)合固定也由該位點調(diào)控（圖7J）。

                                                        圖7 E4-5的701 – 905堿基與IKK相互作用抑制侵襲和NF-κB活性
   總之，本文發(fā)現(xiàn)lncRNA DRAIC表達降低的癌癥中NF-κB靶基因表達增加。 DRAIC下調(diào)增加細胞侵襲和軟瓊脂集落形成；且這取決于NF-κB的激活。 DRAIC與IKK復(fù)合物的亞基相互作用，以抑制它們之間的相互作用、IκBα的磷酸化和NF-κB的激活。DRAIC的這些功能由701-905堿基片段決定。因此，DRAIC lncRNA通過干擾IKK活性，通過抑制NF-κB活化來抑制前列腺癌的進展。
參考文獻：
   Saha Shekhar., Kiran Manjari., Kuscu Canan., Chatrath Ajay., Wotton David., Mayo Marty W., Dutta Anindya.(2020). Long noncoding RNA DRAIC inhibits prostate cancer progression by interacting with IKK to inhibit NF-κB activation. Cancer Res., undefined(undefined), undefined. doi:10.1158/0008-5472.CAN-19-3460.