2型糖尿病的治療新方法—SPION-外泌體載藥

   BAY55-9837是一種潛在的治療2型糖尿病（T2DM）的多肽，能夠誘導(dǎo)葡萄糖（GLC）依賴性胰島素分泌。但BAY55-9837的半衰期短、靶向性差、血GLC反應(yīng)差，限制了其治療效果。如何提高BAY55-9837的血液GLC反應(yīng)是一個(gè)亟待解決的問題。近期一篇發(fā)表在雜志Small上的文章“SPION-Decorated Exosome Delivered BAY55-9837 Targeting the Pancreas through Magnetism to Improve the Blood GLC Response” 報(bào)道了利用工程化的外泌體載藥靶向胰腺治療2型糖尿病的研究。

   在本研究中，我們展示了一種制備載有BAY55-9837的外泌體的方法，該外泌體與超順磁性氧化鐵納米顆粒（SPIONs）相結(jié)合，具有胰島靶向活性，并在磁力（MF）的幫助下增強(qiáng)血液GLC反應(yīng)。載有BAY55-9837的SPION修飾的外泌體的等離子半衰期是無SPION修飾的外泌體的27倍。SIPONs的主動(dòng)靶向性使外泌體獲得良好的靶向性，提高BAY55-9837的血液GLC反應(yīng)能力。體內(nèi)研究表明，載BAY的外泌體載藥能夠增強(qiáng)胰島靶向性，顯著增加胰島素分泌，從而減輕高血糖。慢性給予載BAY的外泌體可顯著改善糖化血紅蛋白和脂質(zhì)。載BAY的外泌體可能是一種很有前途的T2DM肽藥物載體，具有更好的血液GLC反應(yīng)。
結(jié)果：
1.BAY-Exosome-SPION的特征
   載有BAY55-9837的SPION修飾的外泌體的構(gòu)建和純化步驟如圖1A所示。添加羧化殼聚糖（CS）來制備受尺寸控制的SPION。實(shí)驗(yàn)中所用CS修飾的SPION（CS-SPION）的尺寸分布如圖1B所示。在+2.5 mV處測(cè)量離子的zeta電位，羧化CS修飾后電位降至0.28.6 mV（圖1C），這可能與CS的羧基帶負(fù)電荷有關(guān)。接下來，構(gòu)建Tf-SPION并進(jìn)行磁分離純化。圖1D為Tf、CS-SPION、Tf- SPION的FT-IR分析結(jié)果。結(jié)果表明結(jié)合過程中化學(xué)鍵發(fā)生了變化。在此基礎(chǔ)上，研究了Tf-SPION的穩(wěn)定性。圖1E顯示Tf-SPION的大小在形成后的最初幾天內(nèi)保持穩(wěn)定。然而，Tf- SPION在形成后第37天顯著增大。Tf-SPION的高穩(wěn)定性為今后BAY55-9837的SPION修飾的外泌體的合成提供了支持。在合成和純化后，通過以下實(shí)驗(yàn)對(duì)外泌體進(jìn)行評(píng)價(jià)。Western blot分析結(jié)果顯示，磁性分離獲得的外泌體表達(dá)了特征性的外泌體膜蛋白CD9、CD63以及TfR，證實(shí)了外泌體與Tf-SPION的成功結(jié)合(圖1F)。透射電鏡顯示，外泌體呈圓形形態(tài)，分布良好，平均直徑約100 nm（圖1G），符合文獻(xiàn)報(bào)道的外泌體特征。

2.BAY-Exosome-SPION釋放譜、藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和靶向能力
   藥物釋放行為在生物分布、藥代動(dòng)力學(xué)、毒性、藥物滲漏等方面起重要作用，緩釋一般表現(xiàn)出較好的治療活性。圖2A顯示了BAY55-9837從外泌體釋放到培養(yǎng)基中的情況。前5 h外泌體釋放BAY55-9837較明顯，隨后持續(xù)緩慢釋放，60 h后累積釋放量達(dá)62.0%，說明外泌體較好地保護(hù)了BAY55-9837的降解。圖2B為BAY55-9837、BAY-exosome和BAY-exosome-SPION的血清清除曲線。BAY55- 9837表現(xiàn)出較短的壽命；然而，當(dāng)負(fù)載外泌體或外泌體-SPION時(shí)，BAY55-9837可檢測(cè)約120小時(shí)。治療藥物的靶向性是藥物治療的關(guān)鍵。圖2C中的示意圖顯示，在MF的幫助下，螺旋修飾的外泌體傾向于在細(xì)胞表面積聚。圖2D的結(jié)果證實(shí)了在MF存在的情況下，標(biāo)記了紅色染料的外泌體被吸引到MIN-6細(xì)胞表面，增強(qiáng)了BAY55-9837與其受體的細(xì)胞結(jié)合。

3.BAY-Exosome-SPION 對(duì)β-Cell的影響
   2型糖尿病的特點(diǎn)是外周胰島素抵抗和胰島β-細(xì)胞功能障礙，因此，BAY55-9837，exosome，BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION/MF的胰島素促分泌素的影響被調(diào)查。在沒有GLC的情況下，BAY55-9837，exosome，BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION/MF不能誘導(dǎo)胰島素分泌。而在存在GLC的情況下，BAY55-9837，exosome，BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION/MF較對(duì)照組胰島素分泌明顯增加，符合BAY55-9837誘導(dǎo)胰島素分泌的GLC依賴性（圖3A，3C，3D）。與BAY55-9837或BAY-exosome-SPION相比，BAY-exosome-SPION/MF的引入使胰島素分泌增加最大，驗(yàn)證了MF和exosome-SPION的應(yīng)用顯著增強(qiáng)了BAY55-9837對(duì)其受體的結(jié)合效能。然而，無論是否存在GLC，外泌體都不能誘導(dǎo)MIN-6細(xì)胞分泌胰島素（圖3B）。高GLC或脂肪酸水平誘導(dǎo)的活性氧是胰島β細(xì)胞功能障礙的主要原因。因此，將MIN-6細(xì)胞與棕櫚酸一起培養(yǎng)24小時(shí)，以建立氧化損傷模型。如圖3E所示，在0.8 mmol L-1棕櫚酸存在下，100 nmol L-1 BAY55-9837接近峰值濃度，激活了MIN-6細(xì)胞的胰島素分泌；因此，與100 nmol L-1濃度相比，1000 nmol L.1 BAY55- 9837不能顯著增加MIN-6細(xì)胞的胰島素分泌。當(dāng)BAY55-9837濃度低于100 nmol L-1時(shí)，增加BAY55-9837濃度可顯著提高胰島素分泌。因此，在BAY55- 9837、BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION /MF濃度高于100 nmol L-1時(shí)，MIN-6細(xì)胞的胰島素分泌無明顯差異（圖3E，3G，3H）。此外，在0.8 mmol L-1棕櫚酸和GLC存在的情況下，外泌體不能誘導(dǎo)MIN-6細(xì)胞產(chǎn)生胰島素（圖3F）。

4.BAY-Exosome-SPION對(duì)GLC誘導(dǎo)的胰島素分泌信號(hào)通路的影響
   圖4A總結(jié)了VPAC2介導(dǎo)胰島素分泌的可能途徑。AC/cAMP/PKA/Ca2+和AC/cAMP/Epac2/Ca2+信號(hào)通路是參與VPAC2介導(dǎo)的胰島素分泌的兩個(gè)主要信號(hào)通路。圖4B、C顯示，BAY-exosome-SPION/MF隨時(shí)間增加cAMP含量，增強(qiáng)PKA活性，這表明BAY-exosome-SPION/MF在VPAC2介導(dǎo)的通路中誘導(dǎo)胰島素分泌。最近的一項(xiàng)研究表明，Cav1.2的serine 1928 (Ser1928)磷酸化對(duì)調(diào)節(jié)蛋白激酶A （PKA）介導(dǎo)的l型Ca2+通道至關(guān)重要。如圖4D所示，BAY-exosome-SPION/MF可誘導(dǎo)Cav1.2的Ser1928磷酸化，且隨時(shí)間變化，這與PKA活性的變化一致。隨后，利用Ca2+指標(biāo)fluo-3 AM監(jiān)測(cè)MIN-6細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。如圖4E所示，Ca2+內(nèi)流在BAY-exosome- SPION/MF刺激下發(fā)生。為了進(jìn)一步闡明PKA和l型鈣通道在BAY-exosome-SPION誘導(dǎo)的胰島素分泌中的作用，我們使用了PKA （KT5720）和l型鈣通道（NaHS）抑制劑。如圖4F所示，NaHS和KT5720的應(yīng)用明顯抑制了BAY-exosome-SPION/MF誘導(dǎo)的胰島素的分泌。此外，在無Ca2+的培養(yǎng)基中，BAY-exosome-SPION不能誘導(dǎo)胰島素分泌。因此，我們可以得出結(jié)論，在MIN-6細(xì)胞中，BAY-exosome-SPION/MF通過cAMP/PKA/Ltype Ca2+信號(hào)通路促進(jìn)胰島素分泌，這與VPAC2介導(dǎo)的胰島素分泌信號(hào)通路是一致的。

5.BAY-Exosome-SPION在體內(nèi)的分布
   為了確定BAY-exosome-SPION/MF的靶向能力，我們利用非侵入性近紅外熒光技術(shù)（NIRF）研究了Cy5.5標(biāo)記的BAY55-9837或BAY-exosome-SPION在小鼠體內(nèi)的生物分布。如圖5A、C所示，經(jīng)靜脈注射1h后，在肝臟周圍檢測(cè)到微弱的熒光信號(hào)，經(jīng)BAY55-9837處理8 h后，信號(hào)開始下降，幾乎完全消失。同時(shí)，在沒有MF的情況下，經(jīng)BAY-exosome-SPION處理的小鼠肝臟周圍8小時(shí)內(nèi)可觀察到微弱的熒光信號(hào)。在MF （1h）的幫助下，在靜脈注射BAY-exosome-SPION后1h和8h，在胰島和肝臟周圍均觀察到強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，說明BAY-exosome- SPION具有明顯的磁靶向性。此后，小鼠被euthanasia，并收集相關(guān)器官用于NIRF。如圖5B所示，BAY55-9837處理小鼠各器官均未檢測(cè)到熒光信號(hào)。而經(jīng)BAY-exosome-SPION處理的小鼠各主要器官中檢測(cè)到微弱的熒光信號(hào)，驗(yàn)證了基于外泌體的納米給藥系統(tǒng)作為藥物載體具有保護(hù)作用和BAY55-9837的緩釋能力。在BAY-exosome-SPION/MF組中，胰島檢測(cè)到強(qiáng)熒光信號(hào)。此外，對(duì)主要器官熒光強(qiáng)度的定量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。如圖5D所示，與BAY-exosome-SPION組相比，MF的應(yīng)用使胰島的熒光強(qiáng)度增加了約11.5倍。

6.BAY-Exosome-SPION對(duì)2型糖尿病小鼠的治療作用
   為了研究BAY-exosome-SPION / MF對(duì)GLC耐受性和胰島素分泌的急性作用，用BAY55-9837，BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION / MF處理了db / db糖尿病小鼠，然后動(dòng)態(tài)測(cè)量血液GLC和胰島素水平（圖6A）。如預(yù)期的那樣，模型小鼠顯示出GLC耐受性受損，同時(shí)GLC刺激的胰島素分泌顯著減少。與BAY55-9837相比，觀察到BAY-exosome-SPION的GLC降低作用，并一直持續(xù)到120分鐘。在存在MF的情況下使用BAY-exosome-SPION處理比使用BAY-exosome-SPION的單一處理更有效地降低了血漿GLC，這證實(shí)了MF的應(yīng)用顯著增加了BAY-exosome-SPION的局部濃度，因此證明了更好的血液GLC響應(yīng)效果（圖6B）。血漿胰島素水平的改善與血漿GLC水平的變化相符，BAY-exosome-SPION / MF具有最佳的促進(jìn)胰島素分泌的能力，緊隨其后的是BAY-exosome-SPION組，最低的是BAY55-9837組（圖6C）。此外，由于外泌體延長(zhǎng)了BAY55-9837的血漿半衰期，因此在8小時(shí)后再次進(jìn)行了腹膜內(nèi)GLC耐受性測(cè)試（IPGTT），以研究BAY-exosome-SPION/MF對(duì)GLC耐受性和胰島素的影響。 圖6D和圖6E證明僅在BAY-exosome-SPION/MF組中檢測(cè)到顯著的GLC降低作用和促胰島素能力。 與第一個(gè)IPGTT相比，BAY-exosome-SPION在降低血漿GLC水平和促進(jìn)胰島素分泌方面顯示出較弱的能力，而BAY-exosome-SPION/MF在降低血漿GLC水平和促進(jìn)胰島素分泌方面具有相當(dāng)?shù)哪芰?，表明在exosome-SPION 和MF的幫助下，BAY55-9837具有出色的GLC響應(yīng)能力。為了評(píng)估BAY-exosome-SPION/MF對(duì)T2DM的慢性代謝作用，用BAY55-9837，BAY-exosome-SPION和BAY-exosome-SPION / MF處理了模型小鼠。如圖6F，I所示，每天使用BAY-exosome-SPION/MF處理模型小鼠，其糖化血紅蛋白和體重均顯著降低。肝臟在控制碳水化合物代謝和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用，T2DM患者可觀察到肝臟脂質(zhì)代謝功能障礙。我們的結(jié)果顯示，經(jīng)BAY-exosome-SPION/MF處理后，血TG和肝TG均下降(圖6G，H)，表明模型小鼠的肝功能明顯改善。

結(jié)論：
   在本研究中，我們展示了一種制備載有BAY55-9837的SPION修飾的外泌體的方法。BAY-exosomes經(jīng)電穿孔加載BAY55-9837獲得成功。通過Tf-TfR相互作用將Tf-SPION偶聯(lián)到BAY-exosome上，產(chǎn)生BAY-exosome-SPION，從而賦予BAY-exosomes超順磁性。外泌體的保護(hù)作用使BAY55-9837具有更長(zhǎng)的等離子半衰期，而SIPONs的主動(dòng)靶向性使BAY-exosomes獲得良好的靶向性。因此，在MF的幫助下，BAY-exosome-SPION能對(duì)GLC的升高做出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，從而在胰島中積累，促進(jìn)胰島素的分泌。因此，BAY-exosome-SPION/MF被證明是改善T2DM患者血液GLC反應(yīng)的一種有前途的方法。