LncRNA HCP5參與卵巢早衰

    卵巢早衰（POI）的遺傳病因至今已被證實(shí)，但lncRNAs在POI中的作用尚不清楚。那么，小編給大家介紹發(fā)表在“Nucleic Acids Research”上的文章“Long noncoding RNA HCP5 participates in premature ovarian insufficiency by transcriptionally regulating MSH5 and DNA damage repair via YB1”，讓大家詳細(xì)了解LncRNA HCP5在POI中的作用機(jī)制。

     在本研究中，我們在生化性POI（bPOI）患者的顆粒細(xì)胞（GCs）中發(fā)現(xiàn)了一種低表達(dá)的lncRNA HCP5，它破壞了DNA損傷修復(fù)，促進(jìn)了GCs的凋亡。在力學(xué)上，我們發(fā)現(xiàn)HCP5穩(wěn)定了Nyb1和ILF2之間的相互作用，它可以介導(dǎo)YB1向GCs核的轉(zhuǎn)移。HCP5沉默影響了YB1在細(xì)胞核中的定位，降低了YB1與MSH5基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而降低了MSH5的表達(dá)。

結(jié)果：

1.bPOI患者顆粒細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HCP5表達(dá)下調(diào)

    為了探討異常表達(dá)的lncRNAs與POI的關(guān)系，我們首先對bPOI患者和正常人的顆粒細(xì)胞進(jìn)行了微陣列分析。我們發(fā)現(xiàn)159個(gè)lncRNA在患者和對照組之間有差異表達(dá)（圖1A，B）。在這些候選基因中，我們只考慮與POI相關(guān)基因共定位和共表達(dá)的lncRNA。lncRNA HCP5來自6號染色體MSH5基因上游276kb，是唯一一個(gè)POI基因共定位的lncRNA（圖1C）。定量RT-PCR分析證實(shí)，bPOI患者和對照女性的GCs中HCP5的表達(dá)存在差異（圖1D）。此外，我們的結(jié)果表明，HCP5在21周人胎兒的多個(gè)組織中廣泛表達(dá)，在卵巢中表達(dá)相對較高（圖1E）。采用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)檢測HCP5的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，HCP5主要位于細(xì)胞核內(nèi)，尤其是在KGN、COV434和SVOG細(xì)胞的核膜周圍（圖1F），細(xì)胞分離結(jié)合qPCR分析進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖1G）。

2.HCP5調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞MSH5的表達(dá)

    據(jù)報(bào)道，LncRNAs在其鄰近基因中起到順式調(diào)節(jié)作用。鑒于HCP5與MSH5的相鄰定位，我們提出HCP5可能參與MSH5的表達(dá)調(diào)控。RT-qPCR結(jié)果顯示bPOI女性GCs中MSH5較對照組下調(diào)（圖2A），這與HCP5的表達(dá)一致。此外，在KGN細(xì)胞中敲除HCP5導(dǎo)致MSH5在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)明顯降低（圖2B，C）。由于lncRNA-HCP5能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控MSH5的表達(dá)，故進(jìn)一步研究HCP5是否與MSH5-mRNA在GCs中共同表達(dá)。我們檢測了GCs患者和正常人GCs中HCP5和MSH5的表達(dá)。如圖2D所示，lncRNA HCP5與MSH5 mRNA水平顯著相關(guān)。這些結(jié)果表明HCP5在調(diào)節(jié)MSH5表達(dá)中起著重要作用。

3.MSH5是DNA雙鏈斷裂（DSBs）修復(fù)過程中HCP5的靶點(diǎn)  

    MSH5主要參與錯(cuò)配修復(fù)，MSH4-MSH5雜二聚體在DSBs的同源重組（HR）修復(fù)中起重要作用。通過免疫熒光法發(fā)現(xiàn)DSBs的敏感指標(biāo)γH2AX隨修復(fù)過程逐漸消失（圖3A）。western blot檢測γH2AX蛋白水平。結(jié)果表明，HCP5基因敲除明顯延長了ETO誘導(dǎo)的KGN、COV434和SVOG細(xì)胞DSB修復(fù)的時(shí)間（圖3B）。鑒于MSH5在DSBs的HR途徑中的重要作用，我們研究了HCP5基因敲除對喜樹堿（CPT）誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)的影響。與ETO處理一致，γH2AX病灶被觀察到， 并隨著恢復(fù)逐漸消失（圖3C）。此外，沉默HCP5明顯延長了CPT誘導(dǎo)的KGN、COV434和SVOG細(xì)胞DSB修復(fù)的時(shí)間（圖3D）。此外，HCP5基因的敲除顯著增強(qiáng)了ETO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖3E）。

4.HCP5直接與YB1結(jié)合，是其核定位的關(guān)鍵

    為了研究HCP5的蛋白伴侶，采用生物素標(biāo)記的HCP5全長轉(zhuǎn)錄物及其反義轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行RNA下拉和MS聯(lián)合檢測。如圖4A所示，銀染后在50kDa處可見一條不同的HCP5結(jié)合蛋白帶。Western blot證實(shí)YB1在HCP5下拉蛋白中富集（圖4A）。由于RNA下拉實(shí)驗(yàn)揭示了HCP5-YB1在體外的相互作用，我們采用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀法（RIP）檢測HCP5與YB1之間的內(nèi)源性聯(lián)系。用抗YB1抗體進(jìn)行RIP檢測，然后進(jìn)行qRT PCR，證實(shí)了KGN、COV434和SVOG細(xì)胞中HCP5和YB1之間的直接相互作用（圖4B）。然后我們探討了HCP5對其結(jié)合蛋白YB1的調(diào)節(jié)作用。HCP5的敲除并沒有改變YB1在mRNA或蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)（圖4C，D），表明HCP5并不影響YB1在KGN細(xì)胞中的整體表達(dá)?？紤]到Y(jié)B1的活性主要取決于它在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的穿梭，進(jìn)一步研究了HCP5是否參與了YB1的細(xì)胞定位。我們檢測了HCP5沉默后KGN細(xì)胞核質(zhì)部分YB1的表達(dá)。Western blot顯示YB1存在于KGN細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中；然而，HCP5沉默明顯減少了YB1在細(xì)胞核中的存在（圖4E）。免疫熒光分析表明YB1蛋白的核染色減少，排除了HCP5敲除時(shí)YB1的核仁定位（圖4F、G）。這些結(jié)果表明HCP5沉默阻止了YB1向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。

5.HCP5作為ILF2和YB1的RNA支架，對YB1定位到細(xì)胞核至關(guān)重要

    在機(jī)制上，目前還不清楚HCP5是如何誘導(dǎo)YB1定位到細(xì)胞核的?？紤]到ILF2可以與YB1相互作用并調(diào)節(jié)其核定位，我們采用共免疫沉淀的方法來評估HCP5對YB1 - ILF2復(fù)合物的影響。結(jié)果表明，HCP5的敲除降低了YB1抗體共沉淀的ILF2的相對量（圖5A）?？紤]到HCP5在細(xì)胞核，特別是核膜中的定位，我們推測HCP5可能是YB1和ILF2之間的一種模塊化支架。因此，我們進(jìn)行了RIP分析以確認(rèn)HCP5和ILF2之間的相互作用。如預(yù)期，抗ILF2抗體在KGN、COV434和SVOG細(xì)胞中共沉淀HCP5（圖5B）。此外，我們觀察到在RNase A處理后YB1和ILF2之間的聯(lián)系減弱，這進(jìn)一步驗(yàn)證了RNA支架在YB1-ILF2相互作用中的重要作用（圖5C）。最后，ILF2沉默導(dǎo)致YB1的核定位顯著降低，這與HCP5基因敲除時(shí)的結(jié)果一致（圖5D-F）。因此，HCP5可以作為YB1和ILF2相互作用的RNA支架，并可能對YB1的核定位負(fù)責(zé)。

6.HCP5基因敲除降低了與MSH5啟動(dòng)子的YB1結(jié)合并抑制了MSH5的轉(zhuǎn)錄激活

    核YB1可以定位到啟動(dòng)子或其他關(guān)鍵調(diào)控區(qū)的目標(biāo)基因，并開始轉(zhuǎn)錄。我們進(jìn)一步探討了HCP5敲除是否影響了MSH5啟動(dòng)子對YB1的占用。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析和qPCR顯示YB1在MSH5啟動(dòng)子上顯著富集（圖6A）。此外，HCP5的敲除顯著降低YB1與MSH5啟動(dòng)子的結(jié)合（圖6B）。接著，我們研究了HCP5基因敲除對RNA PolⅡ與MSH5啟動(dòng)子結(jié)合的影響。如圖6C所示，HCP5沉默導(dǎo)致RNA Pol II與MSH5啟動(dòng)子的結(jié)合減少，這與HCP5 shRNA對MSH5 mRNA水平的抑制一致。綜上所述，HCP5通過促進(jìn)YB1和RNA PolⅡ向MSH5啟動(dòng)子的募集來調(diào)控MSH5的轉(zhuǎn)錄。

結(jié)論：我們闡明了LncRNA HCP5對人類POI的作用機(jī)制，即HCP5通過直接與YB1結(jié)合并調(diào)控其亞細(xì)胞定位來調(diào)節(jié)MSH5的表達(dá)和GCs的功能。本研究為POI的發(fā)病機(jī)制提供了一種新的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。